1. Chapter 9
Transcription

2. 9.1 Introduction 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase 9.3 The transcription reaction has three stages 9.4 A stalled RNA polymerase can restart 9.5 RNA polymerase consists of multiple subunits RNA Polymerase consists of the core enzyme and sigma factor 9.7 Sigma factor is released at initiation 9.8 Sigma factor controls binding to DNA Promoter recognition depends on consensus sequences Promoter efficiencies can be increased or decreased by mutation 9.11 RNA polymerase binds to one face of DNA Supercoiling is an important feature of transcription Substitution of sigma factors may control initiation Sigma factors directly contact DNA Sigma factors may be organized into cascades Sporulation is controlled by sigma factors Bacterial RNA polymerase has two modes of termination There are two types of terminator in E. coli How does rho factor work? Antitermination is a regulatory event Antitermination requires sites that are independent of the terminators 9.22 More subunits for RNA polymerase
9 转录232
RNA聚合酶催化转录 ,289
RNA聚合酶包括多个亚基 ,294
σ因子控制与DNA的结合 ,297
启动子识别依赖于一致序列 ,302
RNA聚合酶与DNA的一个面连接 ,305
σ因子的置换可能控制起始 ,309
σ因子可能被组织成层叠状253
细菌RNA聚合酶有两种终止模式 ,317
ρ因子如何作用？ ,320
反终止依赖于特异位点 ,323
RNA聚合酶的更多亚基267—3,329

3. 9.1 Introduction
Coding strand of DNA has the same sequence as mRNA. Downstream identifies sequences proceeding farther in the direction of expression; for example, the coding region is downstream of the initiation codon. Primary transcript is the original unmodified RNA product corresponding to a transcription unit. Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription. RNA polymerases are enzymes that synthesize RNA using a DNA template (formally described as DNA-dependent RNA polymerases). Terminator is a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription. Transcription unit is the distance between sites of initiation and termination by RNA polymerase; may include more than one gene. Upstream identifies sequences proceeding in the opposite direction from expression; for example, the bacterial promoter is upstream from the transcription unit, the initiation codon is upstream of the coding region.
Coding strand：
Downstream：
Primary transcript：
Promoter：
RNA polymerases：
Terminator ：
Transcription unit：
Upstream：
在这一部分中，我们将讨论基因表达中的两个问题。
l       RNA聚合酶是如何识别出DNA上的启动子的。这是一个普遍性问题的一个特例：蛋白质是如何识别它们在DNA上的特定位点的。
l       特别的调节蛋白是如何与RNA聚合酶相作用来促进成抑制转录中起始，伸长、结尾各步聚的。在这一章中我们将分析细菌RNA聚合酶与DNA之间的相互作用，从起始接触到转录过程，直至转录完成酶的释放。

4. 9.1 Introduction
Transcription involves synthesis of an RNA chain representing one strand of a DNA duplex. By "representing" we mean that the RNA is identical in sequence with one strand of the DNA, which is called the coding strand. It is complementary to the other strand, which provides the template for its synthesis. This relationship between double-stranded DNA and its single-stranded RNA transcript is recapitulated in Figure 9.1.
转录实现了表达DNA双螺旋中一条键的RNA链的合成。这里表达的意思就是RNA与DNA的一条链序列是相同的，这条链叫做编码链，RNA与另外一条为它的合成提供模板的链互补，双链DNA与转录产生的RHA之间的关系如图Fig11.1所示。
图11.1：概观：RNA聚合酶的功能是复制双链DNA的其中一条链形成RNA
模板链 转录 RNA转录
密码链 RNA序列与模板链互补与密码链相同
RNA是聚合酶催化RNA的合成，在RNA聚合酶与DNA基因的起始端一段特别的区域——启动子结合时，RNA转录便开始了。启动子位于起始点即转录成RNA的第一个碱基处周围。从这一点开始，RNA聚合酶沿模板向前移动，同时合成RNA，直到到达结束序列。这一过程确定了从启动子到终止子之间的一个转录单元。
第十二章将讨论调节蛋白利用各种方法识别转录的基因来促进成抑制细菌RNA聚合酶。第十三章中讲叙单个的调节作用可以归结入调节网中。第二十八和二十九章讨论真核RNA聚合酶与他们的模板之间的与上述相似的相互作用。
（转录不是RNA合成的唯一途径。RNA病毒具有以自身RNA基因 为模板合成RNA的酶：这种瓜产生了感染周期所必须的为蛋白质编码的mRNA。并且提供RNA基因且使感染周期持续下去，但是细胞中合成RNA只有队DNA为模板进行转录这一条途径）。
Figure 9.1 The function of RNA polymerase is to copy one strand of duplex DNA into RNA.

5. 9.1 Introduction
RNA synthesis is catalyzed by the enzyme RNA polymerase. Transcription starts when RNA polymerase binds to a special region, the promoter, at the start of the gene. The promoter surrounds the first base pair that is transcribed into RNA, the startpoint. From this point, RNA polymerase moves along the template, synthesizing RNA, until it reaches a terminator sequence. This action defines a transcription unit that extends from the promoter to the terminator. The critical feature of the transcription unit, depicted in Figure 9.2, is that it constitutes a stretch of DNA expressed via the production of a single RNA molecule. A transcription unit may include more than one gene.
转录单元的主要特征可由图Fig11.2看出，它由一段由单链RNA分子的产生表达的DNA序列组成。一个转录单元可能包含不止一个基因。
图11.2：概观：一个转录单元是一段被转录成单链RNA的 DNA序列，它起始于启动子，结束于终止子。
启动子 近端的 远端的 终止子
起始点
上游 下游
起始点之前的序列被称为起始点的上游，反之称为下游（转录单元以内），按常规的序列书写顺序转录是由左（上游）至右（下游）进行。这与mRNA的一般书写方向由5‘端到3’端是一致的。
为了确切表示编码链，我们对DNA的序列进行编码，起始点后的第一个 基编为+1，往下游依次增大，起始点前的第一个 基为-1，往上游依次减小。
转录的一次产物称为初级转录体，它包括从启动子延伸至结束子包括它的最初的5‘和3’端的RNA序列。然而初级转录体通常是不稳定的。原核中，它很快被降解（mRNA）或酶切得到成熟产物（rRNA和tRNA）。真核中，它被在末端修饰(mRNA)或酶切成为成熟产物（各种RNA）。
转录是基因表达的第一阶段，也是控制基因表达的主要的一步。调节蛋白来决定一段基因能否被RNA聚合酶所转录。调节过程的第一步有时是唯一的一步就是决定是否转录一段基因。在考虑转录的不同阶段时，我们应该注意它被调节活性的可能性。
Figure 9.2 A transcription unit is a sequence of DNA transcribed into a single RNA, starting at the promoter and ending at the terminator.

6. 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
Transcription takes place by the usual process of complementary base pairing, catalyzed and scrutinized by the enzyme RNA polymerase. Figure 9.3 illustrates the general nature of transcription. RNA synthesis takes place within a "transcription bubble," in which DNA is transiently separated into its single strands, and one strand is used as a template for synthesis of the RNA strand. As RNA polymerase moves along the DNA, the bubble moves with it, and the RNA chain grows longer.
一、RNA聚合酶催化转录过程
转录在RNA聚合酶的作用下，通过碱基互补配对的一般过程得以实现。Fig11.3描述了转录的一般过程。RNA的合成是在“转录泡”中实现的，在泡中DNA被分开成为两条单链，一条做为模板，当RNA聚合酶沿DNA移动时，转录泡随之移动，RNA链随之增大。
图11.3:转录发生在一个”泡”中,在该泡中,RNA通过与瞬间解旋区的DNA的一条链进行碱基配对而合成,随着该泡的前进,DNAS在它后边发生变化,以一条单核苷酸链的形式取代RNA
RNA聚合酶中的转录泡→聚合酶移动→RNA链伸长
Figure 9.3 Transcription takes place in a bubble, in which RNA is synthesized by base pairing with one strand of DNA in the transiently unwound region. As the bubble progresses, the DNA duplex reforms behind it, displacing the RNA in the form of a single polynucleotide chain.

7. 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
The structure of the bubble within RNA polymerase is shown in the expanded view of Figure 9.4. As RNA polymerase moves along the DNA template, it unwinds the duplex at the front of the bubble (the unwinding point), and rewinds the DNA at the back (the rewinding point). The length of the transcription bubble varies with the phase of the elongation reaction from 1220 bp (see later), but the length of the RNA-DNA hybrid region within it is shorter (for review see 68).
RNA聚合酶中的转录泡的结构由Fig11.4可看到。当RNA聚合酶沿DNA模板移动时，它打开泡前的DNA双螺旋（在解链点打开），并在复链点使DNA复原，转录泡的长度随增长反应阶段而异，在12-20bp之间，但其中的RNA-DNA杂交体区域比这个长度要短。
图11.4:在转录期间,该泡被保持在细菌RNA聚合酶中,聚合酶解开DNA,复旋DNA,保持相应的模版链的条件,合成RNA
酶移动
复旋点 DNA密码链 解旋点
RNA结合点 催化点 DNA模版链
过去的关于转录的观点认为RNA-DNA杂 体长度约为12bp，但这个数字是由KNA聚合酶内RNA的区域的结构这个间接的证据得出的。实际上，RNA-DNA杂 体的长度并没有被直接测量过，最后的研究结果表明离生长点三个碱基矩离的RNA碱基会被识别出单链RNA的RNA酶价切掉。（这一结果是通过控制下一个要结合入RNA链上的碱基来阻止正在某一位点处于伸长期的RNA聚合酶来实现的）
所以，RNA在生长点之后通过2-3个碱基与DNA相连，然后便是一个与聚合酶的高 区。所以RNA-DNA杂多体很短且是暂时性的，只延伸至使加入的核苷酸有足够的稳定性即停止，当酶移动的时候，DNA双螺旋重新形成，RNA是自由的多核苷酸链，最后加入生长链的约25个核糖核苷酸与DNA或酶形成复合物。
Figure 9.4 During transcription, the bubble is maintained within bacterial RNA polymerase, which unwinds and rewinds DNA, maintains the conditions of the partner and template DNA strands, and synthesizes RNA.

8. 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
Bacterial RNA polymerase has overall dimensions of ~90 ⊙ 95 ⊙ 160 ?. Yeast RNA polymerase is larger but less elongated. Structural analysis shows that they share a common type of structure, in which there is a "channel" or groove on the surface ~25 ? wide that could be the path for DNA. This is illustrated in Figure 9.5 for the example of yeast RNA polymerase. The length of the groove could hold 16 bp in the bacterial enzyme, and ~25 bp in the yeast enzyme, but this represents only part of the total length of DNA bound during transcription. Aside from this general description, we cannot yet relate the features of the enzyme to the generalized structure shown in Figure 9.4.
细菌RNA聚合酶的大概三维体积是90×160，酵母RNA聚合酶比较大但短一些。结构分析表明RNA聚合酶有一个共同的结构形式。表面约25宽的‘通道’成沟，可能是做为DNA的通道。由Fig11.5可看到酵母RNA聚合酶的结构。细菌酶中沟的长度可容纳16bp，酵母中25bp。这只是转录中DNA结合的一部分区域。除了以上基本的描述我们不能氢酶的特点与Fig11.4所示的一般结构联系起来。
图11.5:酵母菌RNA聚合酶有可以成为核苷酸结合位点的沟,粉红色的珠子显示了一条适合约25埃宽的,约5-10埃深的DNA的通过,绿色的珠子显示了一条较窄的通道,约12-15埃宽,约20埃深的能负载RNA,照片由Roger Kopnberg友情提供
Figure 9.5 Yeast RNA polymerase has grooves that could be binding sites for nucleic acids. The pink beads show a possible path for DNA that is ~25 Å wide and 5-10 Å deep. The green beads show a narrower channel.

9. 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
所有的核酸都是由5ˊ-核苷三 酸前体合成的。Fig11.6是进入的核苷酸的5ˊ三磷酸基因链上的与上一个核苷酸的3ˊ-叫基因之间缩合反应的图示。进入的核苷酸失去两个磷酸(αadβ)，它的α基因用于合成磷酸二酯键以下原链连接，这个反应发生在催化位点（见fig11.4）。
图11.6:磷酸二脂键的形成包括一个渗入链的5’-3磷酸基链的最后的核苷的3’-羟基的亲核攻击,失去一个二磷酸基
多核苷酸链的5’末端 链上附加的5’核苷三磷酸基
二磷酸基团的释放
RNA链由5ˊ端向3ˊ合成。总反应速度约为40个核苷酸/秒，（37℃时，对于细菌RNA聚合酶），与翻译速度相差不大（15AA/sec），比DNA复制速度慢得多(8w bp.sec)。
RNA聚合酶控制核苷酸的进入，也许酶使得只有当互补的核苷酸接触到模板碱基时才允许形成磷酸二酯键。如果核苷酸与模板碱基不互补，它会被赶出去，另外一个再进来。如何辨别的机制至今还不清楚，可能并不是因为直接的碱基互补，因为一些碱基类似虽不能配对但仍能加入。
传统观点认为伸长过程是个单一的过程，酶在每个核苷酸加入时向前移动一个bp。在DNA的某些区域是这样的，但在另外一些区域RNA聚合酶的移动很象一支慢慢蠕动的小虫子，酶的左侧边界在RNA链伸长时逐渐前移，在加入几个核苷酸的过程中酶右边界都保持稳定不动，然后突然前移下8bp。
Figure 9.6 Phosphodiester bond formation involves a hydrophilic attack by the 3’-OH group of the last nucleotide of the chain on the 5’ triphosphate of the incoming nucleotide, with release of pyrophosphate.

10. 每一个碱基加上去后,后末端继续移动1bp 酶前末端不移动
9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
fig11.7是这种伸长方式的图示。包括逐渐压缩和突然膨胀的过程。它逐渐由35bp缩小至28bp，然后突然膨胀至35bp。RNA聚合酶缩小时，酶内RNA链的结构伸长。单链转录泡增大，我们相信这些变化产生了酶内的张力，当前端不连续的跃出时，张力消失。
图11.7:在延伸过程中,RNA聚合酶像尺蠖一样移动,从后末端压缩而在前末端释放
一个碱基加到RNA上
酶后末端移动一个碱基 酶前末端不移动
更多的碱基加到RNA上
每一个碱基加上去后,后末端继续移动1bp 酶前末端不移动
约9个碱基加到RNA链上以后
前末端断断续续的移动n个bp
当伸长过程中RNA聚合酶链阻止时会发生一些有趣的反应（典型的是体内反应中核苷酸前体的消失）。切断RNA的3ˊend后，阻断可以解除，因为产生了新的3ˊend使链伸长。酶切反应是真核和原核的酶均有的特点，每次反应都有一个酶自己之外的附加因子。RNA聚合酶的催化位点可能在每次反应中进行真正的切割。
E.wli中的GreA和GreB蛋白，在伸长被阻时，释放出RNA聚合酶。GreA只有在RNA聚合酶被阻断前存在时才发挥作用。被阻断复合物引发裂 反应的特点还不清楚。GreB在酶被阻断后起作用。它的反应被被阻断复合物的出现而引发。
Figure 9.6 RNA polymerase moves like an inchworm during elongation, when it compresses from the back end and release from the front end.

11. 9.2 Transcription is catalyzed by RNA polymerase
The catalytic site of RNA polymerase undertakes the actual cleavage in each case. There have been differences of opinion concerning the change in the enzyme that occurs at this time. One view is that there is an internal reorganization of structure, in which the catalytic center moves relative to the rest of the enzyme. The alternative model shown in Figure 9.6 suggests that the enzyme as a whole "backtracks" on the DNA. The 3 terminus of the RNA is exposed in single-stranded form, and the RNA-DNA hybrid region reverses its position. Cleavage restores a normal elongation complex. This model is supported by more recent measurements showing a constant distance between the catalytic center and the "front end" (505).
动物细胞RNA聚合也需要一个附加因子来从RNA产物的3ˊ端释放核糖核苷酸，酶自己裂解产物，如同Fig11.8中的反应。催化位点在被阻断的酶上，裂释反在使RNA聚合酶沿模板向后移动，或者变换它的催化位点使断的碱基可以加入到新的3ˊ端。RNA结合点是用来安置反应中的RNA聚合酶；这使得RNA聚合酶结合并裂解自由RNA。
图11.8:一个使用的RNA聚合酶能被清除掉转录体3’末端而释放
延伸过程中,RNA聚合酶的普通位点
RNA聚合酶被使用,催化位点被取代
RNA的3’区被清除
催化位点处新的3’末端生成
催化位点重新开始RNA的延伸
我们可以看到RNA聚合酶能易化DNA的解链与复链，控制分开的DNA双链和RNA产物，催化核糖核苷酸加入生长的RNA链，并且利用裂解RNA产物重新开始RNA合成的方式调整自身以确保转录的进行（在附加因子协助下裂解）。
Figure 9.6 A stalled RNA polymerase can be released by cleaving the 3￠ end of the transcript.

12. 9.3 RNA polymerase consists of multiple subunits
Promoter：
Terminator：
Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription. Terminator is a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription.

13. 9.3 RNA polymerase consists of multiple subunits
图11.9:转录有四个时期,包括RNA聚合酶与DNA之间的各种类型的相互作用
酶结合启动子,溶化DNA,起始过程中保持稳定,延伸过程中沿模版链移动,结束过程中降解
模版识别:RNA聚合酶结合到双链DNA上
DNA在启动子处被解旋
初始:2-9个碱基的链被合成与释放
延伸:RNA聚合酶合成RNA解旋区随着RNA聚合酶移动RNA聚合酶到达基因末端
结束:RNA聚合酶与RNA分离
9.3 RNA polymerase consists of multiple subunits
The transcription reaction can be divided into the stages illustrated in Figure 9.7, in which a bubble is created, RNA synthesis begins, the bubble moves along the DNA, and finally is terminated:
二、RNA聚合酶由多个亚基组成
转录反应可以划分为Fig11.9所示的阶段。这个阶段为转录形成，RNA合成开始转录泡沿DNA前进，最后是结束。
l       模板识别开始于RNA结合到双链DNA的启动子上时，然后DNA双链被解开，露出模板。从RNA聚合酶结合点开始通过局部解链形成转录泡。
l       起始指RNA中第一个核苷酸键的合成。酶合成最初约9个核苷酸键时一直停留在启动子上。（当合成键<9时，为无效合成，起始阶段被延长。无效合成部分会被释放，重新合成）当酶成功的合成29个键并离开启动子前移时，起始阶段停止。为RNA聚合酶结合到模板上并完成初始阶段转录所提供的DNA序列称为启动子。
l        伸长阶段中，RNA聚合酶沿模板前移异使RNA链增长。酶前移时，安解开一段DNA链使模板暴露出来。核苷酸共价结合到增长的RNA链的3ˊ端，在解链区形成DNA-RNA杂交体。解链区后面，DNA模板链与原互补链重新回复双螺旋状态。RNA成为自由单链，伸长过程引起破坏DNA结构的转录泡的移动，移动中暂时解链区的模板键与分生的RNA在生长点处配时。
l        结束过程包括结束位点的识别，为了结束转录，就必须停止形成磷酸二酯键，转录复合均必须分开，当最后一个碱基加到RNA链上时，RNA-DNA复合物被破坏的同时，转录泡也被破坏，DNA重新形成双螺旋，酶和RNA均被释放。引起发生这些反在的DNA序列叫做结束子。
RNA聚合酶最初的定义只是因为它能使核苷酸沿DNA模板的顺序加入RNA链中，现在它则被看做转录中包括的复杂装置的一部分。催化RNA的合成只是RNA聚合链酶作用的最小的部分。它指导核糖核苷酸与DNA的配对并催化磷酸二酯键的合成。
Figure 9.7 Transcription has four stages, which involve different types of interaction between RNA polymerase and DNA. The enzyme binds to the promoter and melts DNA, remains stationary during initiation, moves along the template durign elongation, and dissociates at termination.

14. 9.3 RNA polymerase consists of multiple subunits
The complete enzyme or holoenzyme in E. coli has a molecular weight of ~465 kD. Its subunit composition is summarized in Figure 9.8.
当酶必须连接或禽开DNA上的特定位点时，需要一些辅助性的促进作用来起始和结束。RNA的合成，核糖体与蛋白质合成因子之间的分工的相似性是很明显的，有时很难决定在转录过程中出现的特别蛋白质是RNA聚合酶还是辅助因子。
基本的聚合酶中所有的参与伸长的亚基都是起始与结束所必须的，但是转录区间在起始和结束时对额外多肽的依赖性是不同的，有些额外多肽每个基因都需要，有些只是在特别基因起始和结束时需要。一个在所有启动于识别中都需要的辅助多肽就被归类为酶，只有在特别基因起始结束时需要的多肽被称为辅助控制因子。
细菌中的RNA聚合酶的在结构上有所不同,真菌核细胞动物中，一种简单的RNA聚合酶要控制几乎所有的RNA，rRNA和tRNA的合成，一个E.coli细胞中大约有7000个RNA聚合酶分子，许多用来控制转录，在任何时候都有大约 个酶在合成RNA。具体数目由生长状态决定。
E.coli中全酶分子量约465KD, Fig11.10是它的亚基构成图示。
我们现在关于酶的拓扑学的知识还很有限，目前做得最好的是用一张图示来表示不同酶的作用位点。如同Fig11.4中所示。这些位点没有一个已经被在多肽亚基上精确定位过，然而我们有些关于单独的亚基所扮演的角色的大概信息。
β与β′亚基一起构成活性中心，他们的序列与真核RNA聚合酶的最大和亚基的序列有关（see第二十八章），这表明所有RNA聚合酶有一些共同的特征，β亚基可以和模板DVA，产物RNA，底物核苷酸交叉连接，rPOB的突变会影响到转录的每一个阶段,rpoC的突变能证明β′也与所有转录阶段有关系。
图11.10:真菌RNA聚合酶有4种类型的亚单位:αββ’在不同的细菌种类中拥有一定的大小,但是σ变化范围较广
Figure 9.8 Eubacterial RNA polymerases have four types of subunit; a, b, and b have rather constant sizes in different bacterial species, but s varies more widely.

15. 9.4 Sigma factor controls binding to DNA
基因产物 功能
RpoA
2个α亚基
(每一个40KD)
酶组装
启动子识别
结合某些活化子
RpoB
Β基单位
(155KD)
催化中心
RpoC
β’亚单位
(160KD)
RpoD
σ亚单位
(32-90KD)
启动子的特异性
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
α亚基是中心酶的结合所必需的，没有证明它在转录中起到什么直接的作用，然而当噬菌体TA感染E.coli时，α亚基会被ADP核糖基化，引入一个精氨酸，这种修饰使全酶与启动于亲合力降低，所以α亚基在启动识别中起了很重要的作用，α亚基也在RNA聚合酶与调节酶的相互作用中有影响。
这些单独的作用的分配只是大概的；也许是每一个酶都对中心酶的活性起整体性的作用，我们不能把它们的作用分裂开，注意关于DNA结合位点的详细情况这是个最重要的问题我们了解的很少。
α-亚基与启动子的识别有很大关系，关于它的作用我们了解的比其它亚基多一些。
这些酶给出了转录所必需的最小变置的概念，他们识别病毒DNA上的几个启动子；而且他们没有能力把这些启动子转变成他们所能控制的；所以他们在识别特定DNA结合顺序并合成RNA时是受内在能力限制的，这些情况相当复杂。
病毒T3，T7编码的RNA聚合酶是长度<100KD单个多肽链。他们在37℃时以约200核甙酸/秒的速度合成RNA，比细菌RNA聚合酶要快得多，他们的起始作用很相似。
比较来看，宿主细菌的酶能转录，转录单元中的任一个，有一些被直接转录，没有其它的帮助。但有一些单元只有在其它蛋白质因子存在下才能被转录，一些这样的因子对于某个转录单元是有专一性的，其它的因子参与许多转录单元的转录过程，某些噬蓖体能诱导的宿主RNA聚合酶的亲合力发生变化，使它停止识别宿主基因而改为识别病毒的启动子。
所以宿主的酶需要能与各种各样的宿主和改变它的内在转录，活性的噬菌体功能相抗衡的能力，酶的复杂性部分反映了它与其它多种因子发生作用的需要，而不是它的催化活性所要求的。
三、σ因子控制与DNA的结合
（αββ′σ）全酶可以被分为两部分，核心（αββ′）酶和σ因子，名字反映了这样一个事实：只有全酶才能起始转录。当RNA链达到8-9个碱基时，σ因子被释放，核心酶进行伸长过程，核心酶存在DNA模板上合成RNA的能力，但不能够起始转录。
Sigma factor is the subunit of bacterial RNA polymerase needed for initiation; is the major influence on selection of binding sites (promoters).

16. 9.4 Sigma factor controls binding to DNA
图11.12:RNA聚合酶经过几个步骤延伸,一个封闭的二元复合物被转化成为一个开放的形式然后变成三元复合物.
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
We are now in a position to describe the stages of transcription in terms of the interactions between different forms of RNA polymerase and the DNA template. The initiation reaction can be described by the parameters that are summarized in Figure 9.9:我们现在是处于根据不同的RNA聚合酶与DNA不同的相互作用来描绘转录阶段的情况下，起始反应可由Figll.12中所示参数来描述。
反应化合物 反应描述 酶状态
DNA结合 平衡常数 全酶
↓ KB= M 封闭的二元复合物
DNA融合 速度常数
↓ K2= sec-1 开放的二元复合物
失败的起始 速度常数
↓ K1约10-3 sec 三元复合物
σ因子解离 启动子消除时间
>1-2sec RNA合成开始
Δ 全酶与启动子之间的作用从形成闭合的二元复合物开始。“闭合”意为DNA仍是双螺旋形式，因为闭合二元复合物的形成是可逆的，这个反应通常由平衡常数 来描述， 的值域很广。
Δ与酶结合的序列中的一块小区域DNA被溶解后，闭合复合物便转化为开放复合物，形成开放复合物的一系列反应叫做紧密结合，对于强启动子，这个转化是可逆的，所以此反应也由速率常数来表示（K2），这个反应速度很快。
Δ下一步是插入头两个核苷酸，然后在他们中间形成磷酸二酯键，这一步产生包括RNA。DNA和酶的三元复合物，反应由k1来描述，k1比k2还要大，接下来无须酶的移动核苷酸便加到RNA链上直到生成9个碱基的RNA链。所有的碱基都结合上之后，酶会释放RNA链，这个过程包括如果产生了失败的起始，则酶会重新开始合成，失败的起始为起始时只合成了2-9个碱基的寡核苷酶链。
Δ起始成功后，酶释放σ因子并转化为核心酶·DNA·内在RNA的三元复合物，这个过程一个重要的参数是一个聚合酶需要多少时间离开启动子使另一个聚合酶可以开始。这个参数叫做启动子脱离时间，它的最小时间～2S，使得最大频率为每秒<1个，然后酶会沿着模板移动，RNA链延长到10个以列个碱基。
Figure 9.9 RNA polymerase passes through several steps prior to elongation. A closed binary complex is converted to an open form and then into a ternary complex.

17. 9.4 Sigma factor controls binding to DNA
图11.11:RNA聚合酶起初连接从-55到+20区域,当解离时,核心酶与-30连接,当酶移动少量碱基对时,它变得更加紧密,成为普遍的延伸复合体
起始复合体包括σ因子,覆盖75-80bp
起始的延伸复合体由10个碱基组成,丢失σ与-35—55区的连接
普遍延伸复合体由15-20个碱基形成,覆盖34-40bp
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
When RNA polymerase binds to DNA, the elongated dimension of the protein extends along the DNA, but some interesting changes in shape occur during transcription. Transitions in shape and size identify three forms of the complex, as illustrated in Figure 9.10 (501):RNA聚合酶沿DNA伸长延伸，但转录时会发生一些有趣的形状变化，根据形状和大小的变化，可将复合物分为三种：如Figll.11所示。
Δ当RNA聚合酶全酶刚开始结合上DNA，它图片盖75-80bp，从-55延伸至+20，在起始阶段它保持着这个位置。起始阶段中，RNA链在沿起始点迅速延伸的解链区间伸长。（伸展时的RNA聚合酶的长度可以图片盖50个bp，这说明与一般DNA序列的结合需要核酸的弯曲）。
Δσ因子的释放是由从起台到伸长时RNA聚合酶的形状变化而复在的，失σ失因子便失去了与-55-35区间DNA的接触，只剩下约60bp被酶所图片盖，这个过程与一个概念相一致，即启动子上游的一段DNA序列与起起点的识别有关，但不是后来伸长所需要的。
Δ当RNA链延伸至15-20碱基时，酶进一步转化成为控制伸长的复合物，它图片盖30-40个bp（决定于伸长周期的阶段），还不了解伸长开始时所做的转换是否包括酶形状的重要变化，DNA是否被转化为一个稍松驰的结构。
σ因子的作用是保证：RNA聚合酶以稳定的形式与启动子结合，而不是与其它部位结合.
核心酶与DNA之间有亲合性，这种亲合性中基本蛋白与酸性核酸之间的电稳定作用起了重要的作用，也许这种怀序列顺序无关的与DNA结合的普遍性能力是所存在DNA上有结合位点的蛋白质的共同特征（见十二章）。
一些在普遍的结合反应中与核心聚合酶相结合的DNA的序列被称为疏松结合位点。DNA上不发生变化，仍然是双螺旋，这样位点上的复合物是稳定的，酶由DNA上解离下来的半衰期是约60分钟，核心酶不会区分启动子和其它的DNA序列。
σ因子使RNA聚合酶与DNA的亲合性发生变化，核心酶识别疏松结合位点的能力剧烈降低，它能与任一一般的DNA 序列结合。这个反应的结合常数降低了10-4倍，复合物的半衰期<1s。所以，σ因子使普遍的结合能力降低是显而易见的。
σ因子也改变了识别专一位点的能力，全酶能与启动子紧密结合，结合常数比核心酶增长1000倍，半衰期为几个小时。
全酶对启动子的专一性是其它序列的107倍，但结合常数只能做为一个平均数点引用，因为各种不同的全酶与不同的启动子序列结合会有很大差别。在衡量启动子起始转录效率时，这是一个重要的因数。结合常数从1012到106反映了起始效率由1个/S到1个/3分的启动子的频率。
Figure 9.10 RNA polymerase initially contacts the region from -55 to +20. When sigma dissociates,the core enzyme contracts to -30; when the enzyme moves a few base pairs, it becomes more compactly organized into the general elongation complex.

18. 图11.13:核心酶与全酶在DNA上分布,非常少的RNA聚合酶是自由的
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
How is RNA polymerase distributed in the cell? A (somewhat speculative) picture of the enzyme’s situation is depicted in Figure 9.11:
以上讨论的常数数值对于RNA聚合酶的分配有何意义呢？Fig11.13是一张反映酶的情况的图片，来解释这个问题。
个核心酶处于疏松复合物状态
个全酶处于疏松复合物状态
?自由全酶
启动子处封闭与开放复合物的 个全酶
转录中需要约2500个核心酶
Δ多余的核心酶多以闭合疏松复合物形式存在，因为酶与DNA结合速度很快解离速度很慢，所以自由的核心酶数量很少。
Δ存在的σ因子可以提供给1/3的聚合酶以形成全酶，这些σ因子在晨磁针 异位点的疏松复合物和启动子二元复合物中分配。
Δ约一半的RNA聚合酶包括控制转录的核心酶。
Δ有多少全酶是自由的呢？我们不知道，猜测数目应该是比较小的。
Figure 9.11 Core enzyme and holoenzyme are distributed on DNA, and very little RNA polymerase is free.

19. 图11.14:RNA何以如此迅速的在DNA上找到启动子?
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
RNA polymerase must find promoters within the context of the genome. Suppose that a promoter is a stretch of ~60 bp; how is it distinguished from the 4 ⊙ 106 bp that comprise the E. coli genome? Figure 9.12 illustrates the principles of three models.
RNA聚合酶必须在基因组中找到启动子，设想一下，启动子序列内60bp，酶是如何从4×10bp的E1loli基因组中把它们找出来的呢？Figll.14阐明了三个模型的原则最简单的模型是假设RNA聚合酶通过无序扩散移动。本酶与疏松结合位点声速的结合又解离。所以它可以持续不断的形成再断开一系列闭合复合物直到它可启动子相遇，然后通过对将异序列的识别而转化为开放复合物产生紧密结合。 模型
随机向靶位扩散
随机向任意DNA扩散 然后
在DNA间随机的代替
沿DNA滑动
RNA聚合酶若经从一个DNA的结合位点移向另外一个，它必须从第一个位点上解离下来，找到第二个然后与它结合。从一个位点到另一个位点的移动，受在介质中扩散速度的限制，为了保证扩散的进行，酶与靶点的结合常数要有一个上限<108 M-1sec-1，但实际胞外的一些启动子的速度系数约为108 M-1sec-1 ，正处于或大于速度上限。如果在胞内也是如此数值的话，在疏松结合位点上成功的结合与解离过程所需时间对于RNA聚合酶找到启动子来说是太长了。
所以RNA聚合酶必须利用其它方法来到达它的结合点，如果起始靶点是全基因DNA的速率常数就会相应的增大，就不会受到最大限制速度的限制。
如果这种观点是正确的，即一个自由的RNA聚合酶能结合到DNA上并与之紧密结合，那么酶又如何由无序的结合位点移到启动子上的呢？最可能的模型是假设结合序列顺序是由另一个序列直接转移得到的，酶与DNA接触后，声速地转移与自己接触的DNA的序列，直至找到启动子，然后形成稳定，开放复合物，起始开始，因为结合与解离是同时发生的，所以寻找过程变得迅速，在交换位点时并不耗时，直接的转移使得酶迅速移动找到位点。
另外一种观点假设酶以一维无序运动 DNA滑动，直到遇到启动子终止，然而没有证据说明RNA聚合酶（或其它DNA结合蛋白）有此功能。
Figure 9.12 How does RNA polymerase find target promoters so rapidly on DNA?

20. DNA上贮存有的核心酶
σ因子与核心酶结合
全酶对疏松位点有低亲和性
全酶对启动子有高亲和性
σ因子解离
核心酶合成RNA
核心酶刺激与解离
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
RNA polymerase encounters a dilemma in reconciling its needs for initiation with those for elongation. Initiation requires tight binding only to particular sequences (promoters), while elongation requires close association with all sequences that the enzyme encounters during transcription. Figure 9.13 illustrates how the dilemma is solved by the reversible association between sigma factor and core enzyme.
图11.15: σ因子与核心酶在转录德国各个点被重复使用
RNA聚合酶在调节自身对于起始和伸长的需要时会进入一种进退两难的境地。起始需要紧密的结合点只存在于启动子，而伸长需要在转录中酶与所遇到的序列全部闭合型解离。Figll.15 阐明了酶是如何通过σ因子与核心酶之间的可逆结合来解决这一困境的。
σ因子存在起始时起作用，当RNA合成成功的开始时它即被释放，自由的σ因子可以被其它核心酶所利用，我们不知道是σ因子的释放是成功起始的后果还是正是σ因子的释放结束了失败的起始并启动伸长。
σ因子释放后，余下三元复合物中核心酶与DNA紧密结合，在伸长结束前，这种紧密结合是很重要的。当转录结束后，核心酶被释放，它结合到疏松位点上被存计起来备用，为了再进行转录它必须找到一个σ因子与之结合。
核心酶与DNA有很强的内在亲和性，在分生RNA存在时，亲和性会增强，但此时它的亲合性太强以至于无法分解出启动子。σ因子通过降低，疏松位点的稳定性使解离过程更迅速，又通过稳定紧密结合点的结合，使反应不可逆的变为开放复合物的变化，为了避免被对启动子的将异性结合性所麻痹，酶又释放σ因子，从而转化成为对所有DNA的普遍性亲合，以与转录相适应。
是什么控制全酶与启动子特异结合的能力？σ因子有识别启动子的特殊结构式。做为一个独立的多肽键，σ不会与DNA结合，但当全酶形成一个紧密结合的复合体时，σ与启动子上的区域结合。这种变化是由于σ因子与核心酶结合时发生的构象变化而引起的，σ因子的从末端抑制与DNA结合区域的活性；当σ因子与核酶结合后，掏被解除，它便可以特异性的与启动子序列结合。σ因子对启动子的不可识别性是很重要的；若σ因子能与启动子自由结合，它会阻碍全酶起始转录，我们还不清楚核心酶在启动子识别过程中所引起的作用。
Figure 9.13 Sigma factor and core enzyme recycle at different points in transcription.

21. 9.4 Sigma factor controls binding to DNA
四、契合序列决定启动子的识别
如果一级DNA序列是用来被蛋白质识别的，那么它的序列会与那些用来转录或翻的会有所不同，这些关于启动子的作用的信息是直接由DNA序列得到的，结构就是它的信号，一个经典的例子是顺作用位点，如第六章中所讲的，通过比较复在，基因只有在信息被转入其它核酸或蛋白质时才会被表达。
检验RNA聚合酶与它的启动子之间的相互作用的一个主要问题是蛋白质如何识别特异位点。序列的，是否是因为酶有一个能识别DNA双螺旋上特定碱基顺序的化学结构的活性位点。而酶又需要这个位点有什么样的特异性呢？对于不同的RNA聚合酶启动子的亲合力是有差别的。这一点对于控制转录的起始频率以至于控制基因表达的程度上都起着重要的作用。
我们可以通过让RNA聚合酶与DNA结合的方法，找到DNA结合序列所属的起努子的位置。每一个启动子都至少包含这样一段序列，在细菌基因中，能提供结合位点的最短的信号（即结构）是12bpk，（其它更短的序列只是偶而会结合，又会产生大量的错误信号，随基因组规模的扩大，这个最小长宽会增加）。12bp的序列必需是连续的，如果中间被一段序列分开，那么这个结合位点的长度就会小于12bp，因为中间的分离序列全占用一段信号的长度，哪怕这段长度是与信号无关的。
通过比较不同启动子的序列，我们开始尝试着证明DNA的特点对于RNA聚合酶的结合是必要的。一些重要的核苷酸序列在所有的启动子中都存在，这些的序列被称为保守序列。这些序列也没有保守到每一个碱基都不变化的程度。有一些小变化也是允许的，那么我们如何分析一段DNA序列以确定它是否足够保守到可以作为识别信号的程度呢？
可以利用与在大多数结合点都出现的理想序列比较来推断DNA的识别位点。契合序列就是将所有已知序列排列在一起，再找出他们的最大 源性而得到的。如果一个序列被称为是契合序列，它的一些特定碱基必须是永久性的不改变位置，是必须是大多数例子都与这个序列有关而不是少数的几个。
约有1W多个E.coli的启动子已被序列化，其中发现一个有重要意义的问题。就是其中缺少60个bp以上的与RNA聚合酶相连系深度保守序列。大多结合位点的序我之间是不相关的。但一些启动子中的小段序列是保守性的，并且这些序列对于启动子的功能非常重要，只有一小段契合序列有保守性，是真核与原核基因组中调节位点的共同的典型特征。
在细菌基因组中有四个保守的序列：起始点，-10点，-35点，和-10与-35之间的序列
Δ起始点多是（>90%） ，大多数起始点都是序列“CAT”的中间碱基“A”，但这个三联体的保守性并不足以使它成为专一性信号。
Δ起始点上游的一个6bp区间几乎在所有的启动子中都是可识别的。这个六联体的中心与起始点上游10个碱基处相矩很近，已知启动子中这段六联体大多位于位置-18到-8之间，根据它的位置，六联体被命名为-10序列。它的碱基顺序是TATAAT，可以 用下面形式表示T80A95T45A60A50T86下标表示，此碱基出现的频率，在45~96%之间变化。（如果此位置对于任何碱基都没有明显的优先性刚标为“N”）如果碱基的出现频率表明了它在RNA聚合酶结合中的重要性，我们就会猜想上面这个序列是个重要的序列，因为它以保守的TA起始，并以几乎完全保守的结束。
Δ另一个保守六联体在起始点上游-35处，叫做-35序列。契合序列为TTGACA，表示为T82T84G78A65C54A45。
Δ分离-35和-10位点之间的序列90%都在16-18bp之间，它有15~20bp大小。虽然插入序列的确切顺序是不重要的，但它的长度对于使前两个序列适当的分离以适应RNA聚合酶的几何形状是非常重要的。
Figure 9.13 Sigma factor and core enzyme recycle at different points in transcription.

22. 9.4 Sigma factor controls binding to DNA
根据许多启动子点上收集到的数据，我们定义最近启动子为距离起始点，7bp的上游，由-10和-35两外中间间隔17bp的六联体相成的DNA序列，启动子的结构可见图示Fig11.16，图中显示出了启动子可允许变化范围。
图11.16:一个典型的启动子拥有三个化合物,由从-35到-10一致序列,一个启动点组成
9.4 Sigma factor controls binding to DNA
关于启动子的作用的信息主要来源于对突变的研究，启动子的突变影响它所控制的基因的表达水平而不改变基因产物。许多细菌突变被证明会丢失或降低邻近基因的转录，他们被称为低表达突变，少数时候突变会促进转录，这叫做高表达突变。
要注意这里的高与低都是与对应的正常启动子作用相比较得到的。不同的启动子之间差别很大，所以某一个启动子的低表达突变与另外一个是无关的（另外一个可能在野生型时的效率都小于这个突变体）。所以胞内研究得到的信息只能表示突变引起变化的平均趋势。
是否有契合序列的启动子就是最有效的启动子？一个简单的规律可以证明这种假想是不正确的高表达突变通常会增加其一契合序列的同源性或者使两段契合序列之间距离缩小。低表达突变则会降低某个契合序列上的相配性或使两段序列之间距离大于17bp。低表达突变倾向于使中心转移到更保守的位置，这说明了这些位置做为启动子效率的主要决定因素的重要性！
这个规律的偶尔的例外证明启动子的效率并不完全决定于与契合序列的一致性。实际上所有的实际启动子与契合序列都有差别，所以不同的启动子中特定碱基的相邻部分都是不同的。即使碱基自身是保守的，我们不能预测这种情况产生的结果。但一个非契合序列中的碱基可能在一种启动子起有效的作用而在另一种中不能，也有可能是某一位点某种碱基的缺点才是重要的因素而不是某种碱基的存在。
为了得到启动子突变产生的砌切影响，我们必须测量RNA聚合酶在胞内对于野生型和突变株的亲合力：RNA聚合酶对不同启动子的亲合性会有100倍的变化，这与基因在胞同的转录有很大关系，分析得更深一些，我们可以对突变影响启动子能力的阶段进行研究，它是否改变了启动子对RNA聚合酶的亲合性？它是否使酶能够结合而不能起始？或是它改变了辅助因子的影响。
Δ-35序列的低表达突变降低了形成闭合复合物构型的速度（降低KB），但并不掏开放复合物的转化。
Δ-10序列的低水平表达，不影响闭合复合物结构的形成，但它降低开放复合物的转化
这些结果都表明-35序列的作用是为RNA聚合酶的识别提供信号，而-10序列使复合物由闭合转化为开放。所以我们可以认为-35序列包括一个识别结构域，而-10序列包括一个“解链结构域”。
契合-10序列专有一段A-T碱基对，用来使DNA最初溶解为单链，与G-C碱基对相比，A-T解链需能少一些，这说明这一段AT对使DNA的解链所需能量达到最小。
起始点周围的碱基序列对起始作用也有影响，起始转录区间（+1→+30）影响RNA聚合酶沿启动子滑动的速度从而影响启动+的强度。所以启动子的平均强度不能完全由它的-35和-10两个序列来决定。
典型的启动子由被RNA聚合酶所识别的-10和-35序列所决定。但这两个序列中的某一个有可能在一些特例启动子中是不存在的，至少在某些情况下，启动子不能单独的被RNA聚合酶所识别，并且反应酶进行需要辅助因子来解决，RNA聚合酶与启动子之间缺乏内在相互作用这一问题。
Figure 9.13 Sigma factor and core enzyme recycle at different points in transcription.

23. 9.5 Promoter recognition depends on consensus sequences
Consensus sequence is an idealized sequence in which each position represents the base most often found when many actual sequences are compared.

24. 9.5 Promoter recognition depends on consensus sequences
As a sequence of DNA whose function is to be recognized by proteins, a promoter differs from sequences whose role is to be transcribed or translated. The information for promoter function is provided directly by the DNA sequence: its structure is the signal. This is a classic example of a cis-acting site, as defined previously in Figure 1.33 and Figure By contrast, expressed regions gain their meaning only after the information is transferred into the form of some other nucleic acid or protein.
Figure 1.33 Control sites in DNA provide binding sites for proteins; coding regions are expressed via the synthesis of RNA.

25. 9.5 Promoter recognition depends on consensus sequences
As a sequence of DNA whose function is to be recognized by proteins, a promoter differs from sequences whose role is to be transcribed or translated. The information for promoter function is provided directly by the DNA sequence: its structure is the signal. This is a classic example of a cis-acting site, as defined previously in Figure 1.33 and Figure By contrast, expressed regions gain their meaning only after the information is transferred into the form of some other nucleic acid or protein.
Figure A cis-acting site controls the adjacent DNA but does not influence the other allele.

26. 9.5 Promoter recognition depends on consensus sequences
The optimal promoter is a sequence consisting of the 35 hexamer, separated by 17 bp from the 10 hexamer, lying 7 bp upstream of the startpoint. The structure of a promoter, showing the permitted range of variation from this optimum, is illustrated in Figure 9.14.
Figure 9.14 A typical promoter has three components, consisting of consensus sequences at -35 and -10, and the startpoint.

27. 9.5 Promoter recognition depends on consensus sequences
By measuring the kinetic constants for formation of a closed complex and its conversion to an open complex, as defined in Figure 9.9, we can dissect the two stages of the initiation reaction:
Figure 9.9 RNA polymerase passes through several steps prior to elongation. A closed binary complex is converted to an open form and then into a ternary complex.

28. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
Footprinting is a technique for identifying the site on DNA bound by some protein by virtue of the protection of bonds in this region against attack by nucleases.

29. 11.17 印迹法可以通过蛋白质的抗陷作用来确定蛋白质上的DNA结合位点。
如Figl1.17所示，用核酸处理后，用凝胶电泳使DNA片段根据长度不同而分开，每一个有标记末端的片断产生一条荧光带，带所处位置与它的碱基数目对应，最小的片段电泳时移动最声速，被切点与标记末端的距离可以由它的荧光带距凝胶底部的距离得到（见Fig6.3）。
9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
As Figure 9.15 shows, following the nuclease treatment, the broken DNA fragments are recovered and electrophoresed on a gel that separates them according to length. Each fragment that retains a labeled end produces a radioactive band. The position of the band corresponds to the number of bases in the fragment. The shortest fragments move the fastest, so distance from the labeled end is counted up from the bottom of the gel.
五、RNA聚合酶与DNA的倒相结合
RNA聚合酶识别DNA的能力可称为印迹法。一段DNA与蛋白质结合可部分归类为内切酶接触核酸内的单个磷酸二酯键，在适合的情况下，一些FNA分子中的某些磷酸二酯键会断裂，但不会全部断裂。被切的位点是通过一条链上的一端上的标志来识别的，原则与DNA顺序相同，在敏感的末端位点进行标记的分子的部分酶切会产生一段独立片断。
自由DNA中，每一个敏感键都有可能被切断，但DNA与蛋白质结合时，被DNA一结合蛋白复合物覆盖的部分就会被保护起来而不被酶切。若平行进行两个酶切反应；一个使用纯DNA，另一个用DNA与结合蛋白的混合物。只有敏感链被DNA结合蛋白复合物保护起来的时候，它才不会断裂。
在合适的条件下，每个核苷键都被切断，产生一系列电泳带，每条带代表一个碱基。图中可数到31条带，在被保护区中，蛋白质结合部分的键不分断裂，所以与立相对应的片段的带便不会出现，图中9-18带的缺失意味着蛋白质的结合区就在离标记点9-18个碱基距离之处，通过比较两个平行反应的结果，我们便能直接读出与结合点对应的序列，并确定它的核苷酸顺序。
如前Fig11.11所描述的，RNA聚合酶最初结合到-50到+20区域。DNA的两条链并不是同样被保护的，这说明RNA聚合酶结合到DNA上时的构象是不对称的，这决定于只有一条键的DNA是用来转录的。
RNA聚合酶与启动子的结合点可以通过试剂修饰RNA聚合酶+启动子的特定碱基来鉴别。
各种类型的修饰的一个共同特征是他们使多核苷酸键上的对应键断裂，破裂的位点可以用与Fig11.17所示的内切酶印迹法相近的办法获得，我们有两种途径进行这一实验。
Δ与印迹法相近的办法是用修饰性试剂与RNA聚合酶+DNA的复合物相作用并将它的敏感性与自由DNA相比较，一些带消失了，证明这些点上有酶在保护启动子免被修饰，其它一些带增加了，说明在DNA处于暴露状态时必须有这些位点。
Δ可逆实验可以先修饰DNA，然后让它结合到RNA聚合酶上，那些不能与RNA聚合酶相结合的DNA分子被提取出来，仍然用酶切方法得到它的断裂键，断裂点可以用电泳鉴别出来，这些位点就是阻止RNA聚合酶结合到DNA上的前修饰点。
Figure 9.15 Footprinting identifies DNA-binding sites for proteins by their protection against nicking.

30. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
As described previously (see Figure 9.10), RNA polymerase initially binds the region from 50 to +20. The points at which RNA polymerase actually contacts the promoter can be identified by modifying the footprinting technique to treat RNA polymerasepromoter complexes with reagents that modify particular bases. The common feature of all the types of modification is that they allow a breakage to be made at the corresponding bond in the polynucleotide chain. The site of breakage can be identified by the same approach used in footprinting. We can perform the experiment in two ways
Figure RNA polymerase initially contacts the region from -55 to +20. When sigma dissociates,the core enzyme contracts to -30; when the enzyme moves a few base pairs, it becomes more compactly organized into the general elongation complex.

31. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
观察DNA的三维结构，可看出，-10序列上游的接触点均在DNA的分子一侧，图Fig11.18的示图可以看到这一点，图中的被标记的接触位点都是从分子的一侧看到的，大多数位点都在编码链上，这些碱基也许是由闭合二元复合物的起始构象所识别的，让使得RNA聚合酶由一侧接近DNA并识别以至结合成为可能，当DNA解链开始时，分子另一侧的位点才被识制并结合。
9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
These changes in sensitivity reveal the geometry of the complex, as summarized in Figure 9.16 for a typical promoter. The regions at 35 and 10 contain most of the contact points for the enzyme. Within these regions, the same sets of positions tend both to prevent binding if previously modified, and to show increased or decreased susceptibility to modification after binding. Although the points of contact do not coincide completely with sites of mutation, they occur in the same limited region.这些敏感性的变化可揭示出复合物制造出几何形状，如Fig11.18中所示，一个典型的启动子包括-10和-35两处契合序列，一段用于起始解链的区域由-10一直延伸至起始点前，-35和-10区有很多与酶结合的位点，这些区域中的结合位点倾向于在被修饰后便阻止复合物的结合并且会在结合后表现出对修饰剂亲合性的变化，虽然DNA上的与RNA聚合酶的接触位点，冻与突变点完全符合，但他们一定处于相同的有限区间少。
有一点值得指出，那就是不同启动子上的相同位置即使出现的是不同的碱基，也会提供做为接触点，这表明即使RNA聚合酶的结合不依赖于某个特定碱基在某一部位的出现也是有一套通用的结合机制的。这个模型能够解释为什么一些接触点并非突变点。同样突变也不全都发生在接触点上，也许是一些接触点影响了它周围未与酶接触的邻近区域。
这些修饰后进行的实验只有鉴别那些被酶保护不受修饰的同样的区域中的位点，上两个实验可用来鉴别不同的情况下的序列。前修饰能鉴别那些酶结合DNA所必需的位点，而保护实验鉴别与双元复合物相接触的位点，被保护的位点包括所有的识别位点和一些额外位点，这意味着酶先通过识别一系列基础基而与DNA结合，再延伸它的接触到一些额外的碱基上。
在多元复合物中被解链的DNA区域可直接通过它的可接触性的变化而鉴别出来，当DNA链段解开时，一些与DNA双螺旋状态不能反应的试剂可与之发生作用。RNA聚事酶+DNA双元复合物中的位点的敏感性表明他们处于解链区。甲基化A或C的实现能辩制出起始溶解时反应处于-9和+3的位置，这里的起始解链区包括-10序列右端直到刚过起始点。
起始反应时解链的重要性在于超螺旋的影响，当模板处于超螺旋状态时真核与原核在胞内起始转录的效率都会升高，因为超螺旋结构解链时需能较少。
一些启动子的效率受超螺旋程度的影响，最普便的关系是只有负的超螺旋才能实现转录，我们已经了解了它支持起始反应的原理，但是为什么有些启动子受超螺旋程度的影响而另一些则不然？一个可能性是启动子对超螺旋的依赖性决定于它的序列，可以预测一些启动子有易于溶解的序列而另一些是不易溶解的，也就是说如果细菌染色体的不同区域有不同的超螺旋度，这时启动子的位置是非常重要的。
Figure 9.16 One face of the promoter contains the contact points for RNA.

32. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
Supercoiling also has a continuing involvement with transcription. As RNA polymerase transcribes DNA, unwinding and rewinding occurs, as illustrated in Figure 9.3. This requires that either the entire transcription complex rotates about the DNA or the DNA itself must rotate about its helical axis. The consequences of the rotation of DNA are illustrated in Figure 9.17 in the twin domain model for transcription. As RNA polymerase pushes forward along the double helix, it generates positive supercoils (more tightly wound DNA) ahead and leaves negative supercoils (partially unwound DNA) behind. For each helical turn traversed by RNA polymerase, +1 turn is generated ahead and 1 turn behind (506).
Figure 9.3 Transcription takes place in a bubble, in which RNA is synthesized by base pairing with one strand of DNA in the transiently unwound region. As the bubble progresses, the DNA duplex reforms behind it, displacing the RNA in the form of a single polynucleotide chain.

33. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
11.19 转录可能能导致在RNA聚合酶前的DNA片断缠绕更紧密（正超螺旋），在其后的变得缠绕的不那么紧密。
9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
Supercoiling also has a continuing involvement with transcription. As RNA polymerase transcribes DNA, unwinding and rewinding occurs, as illustrated in Figure 9.3. This requires that either the entire transcription complex rotates about the DNA or the DNA itself must rotate about its helical axis. The consequences of the rotation of DNA are illustrated in Figure 9.17 in the twin domain model for transcription. As RNA polymerase pushes forward along the double helix, it generates positive supercoils (more tightly wound DNA) ahead and leaves negative supercoils (partially unwound DNA) behind. For each helical turn traversed by RNA polymerase, +1 turn is generated ahead and 1 turn behind (506).
超螺旋与转录还有更多的关系，RNA聚合酶转录DNA时，解链和复链同时也发生，如同Fig113中所示，这需要整个转录复合体绕DNA旋转或者DNA自己绕它的双链轴旋转，DNA旋转的后果如Fig11.19所示，图中是一个转录的双结构域模型，当RNA聚合酶沿DNA前移时，在酶前产生正双螺旋（比正常DNA更紧密），酶后为负的双螺旋（疏松）；每一个双螺旋转角被RNA跨越后都会在前面产生+1转角，后面产生-1转角。
转录对于原DNA的结构产生重要的影响，这就需要回旋酶和拓扑异构酶来纠正酶前后序列结构的位置，如果回旋酶和拓扑异构酶的活性被阻断，转录便会引起DNA超螺旋的很大变化。例如，在缺乏解开负超螺旋酶的酵母的胞中，转录区的负超螺旋密度会达到正常的两倍，这种现象可能的解释是转录控制细胞中超螺旋的含量。
复制中也会出现与之相似的情况，当移动的复制叉中的DNA必须被解链时，（此时单链DNA做为模板进行复制）超螺旋含量会有变化，第十七章中Fig17.14会有关于这一现象的解释。
Figure 9.17 Transcription may generate more tightly wound (positively supercoiled) DNA ahead of RNA polymerase, while the DNA behind becomes less tightly wound (negatively supercoiled).

34. 9.6 RNA polymerase binds to one face of DNA
A similar situation occurs in replication, when DNA must be unwound at a moving replication fork, so that the individual single strands can be used as templates to synthesize daughter strands. Solutions for the topological constraints associated with such reactions are indicated later in Figure
Figure Separation of the strands of a DNA double helix could be achieved by several means.

35. TABLE 11.1 大肠杆菌的σ因子以不同的交感序列结合到启动子上。
9.7 Substitution of sigma factors may control initiation
六、σ因子的替换控制起始
E.col RNA聚合酶能转录所有的细菌基因，它需要能识别各种不同的启动子，这些启动子控制着在各种条件下以各种程度转录的基因，在不同启动子上起始转录的能力是由支持或阻断酶的辅助因子来控制的。
没有一个例子表明核心酶的亚基中发生了什么变化。但这种不变的理论是不受欢迎的。因为如果是这样，那么RNA聚合酶为了识别一种启动子而发生的变化会阻碍它与另一种启动子的结合，这样就会降低酶的灵活性。
控制链伸长的核心酶与控制结合上选择的σ因子之间的分子马上会让人联想到下一个问题：是否存在多种σ因子，以识别不同类型的启动子？
当有大量转录的重新开始时，σ因子会发生变化，例如在正形成孢子的菌中的生命形成变化时，E.loi不会发生巨大变化。但会变换σ因子以适应外界环境的变化。Table11.1中已列出一些σ因子识别的启动子序列（他们根据产物分子量或基因命名）。σ32σEσ54都是在环境变化中被激活的。σ28是用于正常生长中的革命毛基因表达，但它表达的程度由环境变化决定，除σ54外所有的σ因子都属于同一个蛋白质家族并且以同样的方式在转录前发生作用。
当细菌周围环境温度升高时，它会改变自身的转录方式以适应热刺激，通常的变化有下述几种机制，真核与原核相同，当温度升高时，正在进行的蛋白质的合成会停止或大量减少，而转生成另外一套蛋白质，这些新蛋白质是热激基因的产物，它们在外界环境变化如温度升高时被合成，在保护的首、菌 受环境互近中起了重要的作用。几种热激蛋白具是伴侣分子，E.coli中17个热激蛋白表达是通过引发转录的变化实现的，基因RrpOH是一个热激反应的转换中所需的一个调节因子，它的产物是σ32，σ32是产生热激基因转录的替代σ因子。
热激反应通过调节σ32的量和活性来实现，温度升高时，σ32浓度升高，温度回降时，σ32的活性降低，诱导σ32产生的基本信号是因温度升高而得到的未折蛋白的聚集。
另一些热调节基因由σ32因子来控制，它在比出现σ32更剧烈的环境变化反映中出现，也由未折叠蛋白诱导产生，这些蛋白正常时多存在于胞外膜或外周胞质间隙中，关于这种σ因子和它所控制的信息了解的不多。
还有一种σ因子在缺N时出现，当培养基中缺乏氟时，Eloli中会有少量σ54存在，这种情况下，基因会转向利用其它可替代的N源，与这种σ因子相对应的其它物质已经在很多细菌中被找到，所以说这表明在进化中已经存在这样一种反应规则。
Figure 9.18 E. coli sigma factors recognize promoters with different consensus sequences. (Numbers in the name of a factor indicate its mass.)

36. 9.7 Substitution of sigma factors may control initiation
11.20 大肠杆菌σ70因子的图谱定位了4个在其他σ因子中也极为保守的区域。区域2和4内的序列可结合-10和-35位的启动子因素。区域2的另外一部分用于融合DNA。 位残基在结合核合酶是必需的。N-末端区域避免了区域2和4在无核心酶的情况下结合DNA.
通过几和细菌σ因子序列的比较便能鉴别出保守序列，我们猜测他们起了重要的功能作用，有4个这样的区域，Fig20中可看到他们在E.loliσ70中的位置。
9.7 Substitution of sigma factors may control initiation
Comparisons of the sequences of several bacterial sigma factors identify regions that have been conserved. Their locations in E. coli 70 are summarized in Figure 9.19 (503).
σ因子进化的另外一种形式可由因子σF看到，σF因子含量很少，它能转录产生毒性和鞭毛结构的基因，它在B.Subtilis（枯草杆菌）中的对应物为σD。σD是用来控制鞭毛和游动性基因的。具体相同启动子特异性的因子还出现在许多种细菌中。
多种σ因子的存在使我们对σ因子与核心酶的关系，提出进一步的问题，是什么控制着σ因子与核心酶之间的联系，是否是这种控制过程决定了得到的全酶的类型？在启动子识别的专一性控制中σ因子又起了什么作用？
关于生长中的细菌中σ因子之间关系的控制我们了解的不多，细胞对于外界条件变化（如热刺激或缺N源）的反应是由胞内新的σ因子的生成决定的，我们可以假设，在热刺激下基因转录的选择是由一般性的σ70与热激性因子σ32之间的平衡决定的。两个σ因子竞争已有的核心酶，σ32蛋白是不稳定的，它的质量增加或减少的很快，这在它的调节中是一个重要的特点。
每一种σ因子都使RNA聚合酶起始某一系列启动子，通过分析这些启动子的序列，我们发现每个系列都有一段特别的序列，这段序列保证使这些启动子被特定的由对应σ因子所引导的RNA聚合酶识别。我们可以根据在大肠杆菌中发现，且在B.Subtil的胞小形成中也存在的由σ因子的基因鉴别导致的启动子的识别推导出一个一般规律。
每一个酶的启动子的重要特点是：他们有相同的大小和相同的相对于起始点的位置，他们都只在-10和-35处有保守序列，每一系列的启动子的保守序列都与其它系列有所不同，或者在某一个保守序列上，或者两个保守序列都不同，这样每一个带有特别σ因子的酶就会识别自己的一系列启动子，导致每一种基因的转录都是相互独立的，所以一种σ因子被另一种σ因子替代就会导致一套旧转录系统被另一套转录系统所替代。
在-10及-35位点区被全酶所识别的一系列不同的保守 序列的定义隐含着一个意思，就是σ亚基必须与这些区域的DNA相接触，这就显示出一个基本的原则：在σ因子与核心酶之间有着某种普遍性的关系，这种关系使得σ因子与核心酶以某些特别方式结合以使它能与-35和-10区域发生重要的接触 ，我们现在还不能解决这个问题，究竟为什么一段小的多肽键可以与DNA上一段长于20年试基的序列明显的接触。
Figure 9.19 A map of the E. coli s70 factor identifies conserved regions. Regions 2.1 and 2.2 contact core polymerase, 2.3 is required for melting, and 2.4 and 4.2 contact the -10 and -35 promoter elements.

37. 9.7 Substitution of sigma factors may control initiation
The use of -helical motifs in proteins to recognize duplex DNA sequences is common, as we see in more detail in Chapters 10 and 11. Amino acids separated by 34 positions lie on the same face of an -helix and are therefore in a position to contact adjacent base pairs. Figure 9.20 shows that amino acids lying along one face of the 2.4 region -helix contact the bases at positions 12 to 10 of the 10 promoter sequence.
σ因子与-10和-35序列接触的直接证据来自σ因子保守序列的突变，当启动子上特定位点的突变性阻止RNA降合酶的识别，而σ因子上的补偿性突变又使RNA聚合酶能够与突变后的启动子结合时，我们便可以推断DNA上有关的试基与被替代的AA相接触。Fig11.20显示出区域2和4（2.4和4.2）中的两个短片段分别包含了-10和-35区的接触试基，这两上区域形成了蛋白质中的短的σ螺旋片段。
σ因子的其它部分来被来格证明有单独的作用，区域2的一部分中有与结俣单链核酸的蛋白相似的序列，也许因此而与溶解反应有关，区2之前与起点重叠的一段序列似乎在与核心酶的反应中是必要的。
如果σ70的N末端区域被移走，缩短了的蛋白就会与启动子序列特异的结合，这对于全蛋白来说是不可能的，这说明σ70自由时，它的N末端包含了与DNA相结合的区域，而且也说明与核心酶的结合改变了σ因子的构象使之能与DNA相结合。
11.21 在大肠杆菌σ70的2.4α-螺旋或B.subtilis的 σA上的相应位置上的氨基酸可能结合-10启动子序列的前2个碱基对。
通常蛋白质的利用σ螺旋模体来识别DNA双螺旋，这个问题的细节我们在12、13章中讨论Figll.21图示表现出σ帽货中相隔3~4个位置的AA是如何结合到DNA双螺旋的同一侧并且能够接触到相邻的碱基对，在对Eloliσ70和 的研究中发现位于相应位置上的thr和 负责与-10区的头两个位置相接触，现在还不清楚-10的其它序列是如何接触到σ因子上的。
在σ54中发现了一种不同的行为，它使RNA聚合酶能够识别处于=10和-20位点的保守序列，所以在这种σ因子指直下产生的聚合酶+启动子复合物的几何性质是与其它不同的，这与调节方式的改变有联系，转录中的启动子由与它相矩较远的区域来控制自己的活性，而不是由好些矩启动子近一些的区域，σ54的行为与其它σ因子不同，主要是因为它可以独立地与DNA结合而不需要核心酶，这与28章要讨论的直接调节因子更相似，而不象12、13章中的原核调节因子。
Figure 9.20 Amino acids in the 2.4 a-helix of s70 contact specific bases in the nontemplate strand of the -10 promoter sequence.

38. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
Sporulation is the generation of a spore by a bacterium (by morphological conversion) or by a yeast (as the product of meiosis).

39. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
11.22 σ因子能改变起始的特异性，它的两个连续亚基可控制噬菌体SP01基因的转录。
Expression of phage genes is required for the transitions to middle and late gene transcription. Three regulatory genes, named 28, 33, and 34, control the course of transcription. Their functions are summarized in Figure The pattern of regulation creates a cascade, in which the host enzyme transcribes an early gene whose product is needed to transcribe the middle genes; and then two of the middle genes code for products that are needed to transcribe the late genes.
七、芽孢的产生涉及了许多Sigma因子的联级反应
在B.Subtilis细菌中，更折Sigma因子用于控制转录的起始。已知有大约10种不同的种类。其中有些存在于营养细胞中，而另一些只有在病毒侵袭或是从营养生长转为孢子生长的特殊情况下才会产生。
在B.subtilis的细胞中发现的用于一般营养生长的主要RNA聚合酶与E.coli细胞中的相应的酶结构一样，都是α2ββ′β型。它的Sigma因子所辨识的契合序列也与E.coli中的酶一样，一些具有其它Sigma因子的RNA聚合酶变体以小得多的数量存在。在病毒侵袭细菌的过程中，一个普遍的特点是在不同组基因表达的转化过程中，这些变体RNA聚合酶可以辨认不同的起始因子。除去最简单的一般情况中，病毒在侵染周期的生长都涉及转录方式的改变。这些改变伴随着病毒所编码的RNA聚酶的合成或是它所编码的控制细菌RNA聚合酶的辅助因子的起作用而完成的，一个通过新Sigma因子的合成而控制细胞状态的例子是SPOI病毒侵袭B.subtilis细菌。
在侵袭周期中，SPOI的基因表达经过3个阶段。在侵染后不久，病毒的早期基因被转录。大约4-5分钟后，早期基因转录停止中期基因开始转录。然后8-12分钟后，晚期基因代替了中期基因而被表达。
早期基因靠宿主细胞的全酶被转录。相对于可被RNA聚合酶识别的宿主细胞基因，它们是不可区分的，具有相同的本质。
病毒基因的表达必须从早期基因的转录转到中期和晚期基因上。名为28，33和34的三个调控基因控制它们的转录。表11.22总结了它们的作用。它们的调节方式为联级型，例如宿主的酶所转录的一个早期基因的产物用于中期基因的转录。然两个中期基因所编码的产物又用于晚期基因的转录。
早期基因28的突变体不能转录中期基因。基因28的产物， 一家子8j g wh
26KD的蛋白质，它将取代宿主Sigma因子与核心酶结合。这个替换就唯一地完成了从早期基因到中期基因表达的转变。它产生的全酶不再能转录宿主细胞基因，而能转录中期基因。我们并不知道gp28是如何取代σ43因子，也不清楚在宿主Sigma肽链上发生了什么变化。
Figure 9.21 Transcription of phage SPO1 genes is controlled by two successive substitutions of the sigma factor that change the initiation specificity.

40. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
11.23 sporulation包括一个植物性细胞。
9.8 Sigma factors may be organized into cascades
Perhaps the most extensive example of switches in sigma factors is provided by sporulation, an alternative lifestyle available to some bacteria. At the end of the vegetative phase in a bacterial culture, logarithmic growth ceases because nutrients in the medium become depleted. This triggers sporulation, as illustrated in Figure DNA is replicated, a genome is segregated at one end of the cell, and eventually it is surrounded by the tough spore coat. When the septum forms, it generates two independent compartments, the mother cell and the forespore. At the start of the process, one chromosome is attached to each pole of the cell. The growing septum traps part of one chromosome in the forespore, and then a translocase (SpoIIIE) pumps the rest of the chromosome into the forespore.
在下一个转变过程中涉及了两个中期基因。无论是基因33还是基因34的突变都会停止晚期基因的转录。这两个基因的产物分别是13KD和24KD的蛋白质，它们代替gp28与核心酶结合。我们仍然不知道gp 34和gp34是怎样挤走 不定期28（或是宿主的σ43因子），总之是它们一旦与核心酶结合，就只能起始晚期基因的转录。
Sigma因子的连续替换具有双重意义。每一次当组分变化时，RNA聚合酶都可以辩认一系列新的基因，而不再对以前的基因起作用。这些改变就构成了RNA聚合酶活性的所有变化。几乎所有的或实际上所有的核心酶在瞬时都是与当时Sigma因子结合，并且这种改变不可逆。或许芽胞形成是Sigma因子替换的一个最明显的例子。芽孢生长是一些细菌一个交替的生长周期。在营养生长阶段的末期，由于养料已被消耗完，指数生长停止，于是引发了芽孢生长，如图11。23所示。基因被复制，一个基因组在细胞的一端被隔离，并最终被一层坚厚的芽孢外衣所包被。当隔膜形成后，形成了两个室，亲代室和前孢子。整个过程经历8个小时，也可以被当作一种基本的分化形式，一个亲代细胞（营养型细菌）生成两个不同的子代细胞，它们具有不同的命运，亲代室细胞最终被分解，而孢子以一种完全不同于初始细胞的结构被释放。
细菌在芽胞形成过程中，放多基因的生物合成活性都发生了很大的改变。控制的主要阶段 在于转录过程。在芽孢的形成过程中，一些在营养生长阶段起作用的基因被关掉，但大多数仍在继续被表达。此外，一些对于芽孢生长特异的基因只顺此时被表达。在芽孢生长的最后阶段，大约40%的细菌mRNA都是芽孢生长特异的。
Figure 9.22 Sporulation involves the differentiation of a vegetative bacterium into a mother cell that is lysed and a spore that is released.

41. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
11.24 sporulation包括了能控制RNA聚合酶起始特异性的σ因子的连续变化。在前孢子的？cascades和母细胞是被穿过间隔的信号所联系的。
9.8 Sigma factors may be organized into cascades
新的RNA聚合酶在出芽细胞中具有活性。它们的核心酶与营养生长细胞一样，只是用不同的蛋白质替代了营养生长中的σ43因子。表11.24总结了转录特异性的变化。基本原则是在每个室中，现存的Sigma因子连续地被新的因子所取代，从而导致不同组基因的转录。而前孢子与亲代室之间的交流用以谐调这些变化的时间。当环境因素引发了“磷酸传递”，即一个磷酸根穿过一系列蛋白质到达SPODA时，芽孢形成的联级效应被触发。（在这个过程涉及了几个基因的产物，它的复杂性可能反映了避免不必要引发孢子生成的需要。SpoOA是一个活性受是否磷酸化影响的转录调挖子。在磷酸化的形式中，它激活了两个操纵子的转录，这两个操纵子的转录由不同的RNA聚合酶所控制。在磷酸化SPOOA的控制下，宿主酶用普遍的σ43因子转录了编码σF的因子，并且在一个弱因子σH的指导下，转录了编码了前-σE因子的基因。这两个新的Sigma因子在隔膜形成前产生，而在之后具有活性。
σF只在前孢子中具有活性，或许是因为亲代室细胞中存在有抑制因子，减低了它的活性。当前孢子中的σF的因子替代了σ43因子，芽孢生长开始。在σF因子的控制下，RNA矣合酶转录第一组芽孢生长基因，代替了以前转录的营养生长基因。由于只生成了较小规模的σF因子，因而替代反应只发生了部分的RNA聚合酶上。在芽孢生长中，一些营养型酶仍然存在。被替代的σ43因子并没有被破坏，从出芽细胞的提取液中仍能恢复它们的活性。
在σF作用之后有两个控制事件。在前孢子当中，另一个早期出芽基因的产物σG是Sigma因子。σG是引起RNA聚合酶转录前孢子晚期基因的因子。另一个早期基因的产物用于与亲代室细胞的交流，有信号通过镶嵌在隔膜上的蛋白质被传递到亲代室细胞，以激活σF因子。σF因子以前-σF的形式被合成并且存在。当前-σF因子分解时产生。
当σF反过来引起基因转录产生σK时，联级反应继续进行。（实际上，σK的产生相当复杂，因为它的基因是由重组生成的）。这个因子也以不具有活性的前体形式，pro-σK时被合成，由一个蛋白水解酶激活。σK一旦被激活，就取代了σE因子，并且引起了亲代室细胞中晚期基因的转录。两个孢室中这些事件的时间由进一步的信号控制。前孢子中σG的活性依赖于亲代室细胞中的事件。反过来，σG的活性又涉及到一跨隔膜信号的产生，用以激活σK因子。
芽孢生长就过样由两个联级反应控制。在每一个胞室中，Sigma因子连续被激活，每一个新的Sigma因子都控制一组不同基因的合成。两个联级反应通过胞室间的信号连接起来。当新的基因具有活性时，原先的基因被替换，这样Sigma因子的变换开掉并且关上相应的基因。RNA聚合酶引入每一个因子记录了它的靶组基因开始表达的时间；可获得的因子的数量影响基因表达的程度。在任一时刻可能不止一个Sigma因子具有活性，某些Sigma因子的特异性是重叠的，我们并不清楚是什么使得每一个Sigma因子替换它的前者。
Figure 9.23 Sporulation involves successive changes in the sigma factors that control the initiation specificity of RNA polymerase. The cascades in the forespore (left) and the mother cell (right) are related by signals passed across the septum (indicated by horizontal arrows).

42. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
Two regulatory events follow from the activity of F, as detailed in Figure In the forespore itself, another factor, G, is the product of one of the early sporulation genes. G is the factor that causes RNA polymerase to transcribe the late sporulation genes in the forespore. Another early sporulation gene product is responsible for communicating with the mother cell compartment. F activates SpoIIR, which is secreted from the forespore. It then activates the membrane-bound protein SpoIIGA to cleave the inactive precursor pro-E into the active factor E in the mother cell. (Any E that is produced in the forespore is degraded by forespore-specific functions.)
Figure 9.24 sF triggers synthesis of the next sigma factor in the forespore (sG) and turns on SpoIIR which causes SpoIIGA to cleave pro-sE.

43. 9.8 Sigma factors may be organized into cascades
Sporulation is thus controlled by two cascades, in which sigma factors in each compartment are successively activated, each directing the synthesis of a particular set of genes. Figure 9.25 outlines how the two cascades are connected by the transmission of signals from one compartment to the other. As new sigma factors become active, old sigma factors are displaced, so that transitions in sigma factors turn genes off as well as on. The incorporation of each factor into RNA polymerase dictates when its set of target genes is expressed; and the amount of factor available influences the level of gene expression. More than one sigma factor may be active at any time, and the specificities of some of the sigma factors overlap. We do not know what is responsible for the ability of each sigma factor to replace its predecessor (for review see 77, 78, 81).
Figure 9.25 The criss-cross regulation of sporulation coordinates timing of events in the mother cell and forespore.

44. 9.9 Bacterial RNA polymerase has two modes of termination
Terminator is a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription.
八、细菌RNA聚合酶有2种停止方式
RNA聚合酶一旦起始转录，它就沿着模板移动，合成RNA，直至遇到了停止序列。在终止点上，酶停止向生长的RNA链添加新的酶，释放终产物，并且从DNA模板上分离。（我们不知道最后两个事件发生的先后顺序）。终止要求维持RNA-DNA杂合体的所有氢键断裂，然DNA双螺旋形成。
定义在体内合成的RNA分子的终止是困难的，由于初级转录体的断裂总可能产生新的 端，因此 端并不代表RNA聚合酶终止的实际位点。不幸的是，不论是终止还是断裂产生的分端看上去是完全一样的。没有像可以标记的原始分端的三磷酸根那样的物质。
RNA体外终止系统提供了最好的标记终止的方法。但由于酶的终止能力受诸如离子强度等其它因素的影响较大，它在体外的终止点并不能被证明自然终止了。但是当体内和体外终止过程中出现同样的分端，我们就可以认为，这个分端就是实际的终止点。
细菌及其病毒的终止子就是发生体内或体外结束反应所必须的序列。在终止效率和辅助因子的依赖性上，它们相差很远，至少在体外是这样。许多终止了要求正被转录的RNA二级结构形成“发卡”。这说明终止依靠于RNA产物，而并不是简单地被转录中的DNA序列所决定。
在一些终止子中，某些与RNA聚合酶反应的辅助因子可以防止终止的发生。多终止引起酶跳过终止子序列而继续转录，这个过程被称作是“通读”。（也可用于形容核糖体对终上密码识别的抑制）。
在研究终止事件时，我们不能简单地把它当作一个使RNA分子产生分端的机制，而应当把它当作控制基因表达的一种办法。这样什么时候RNA聚合酶与DNA结合（起始）或什么时候解离（终止）都在特殊的控制之中。在起始和终止的机制中，存在着许多有趣的一致，都需要氢键的断裂（起始时DNA开始融化，终止时RNA-DNA的解离），并且两个过程都需要与核心酶反应的附加蛋白质。实际上，这两个过程的完成都伴随着酶的不同形式的交替。不过，起始过程完全依赖于RNA聚合酶与DNA双螺旋间的作用，而终止事件涉及RNA聚合酶合成的转录体或辅助因子的信号识别。
原核终止子的序列在最后一个RNA碱基将要被加上的那一点之后没有相似性。已经被RNA聚合酶转录了的序列承担了终止任务。这样，终止是由模板的解毒或酶正在合成的产物来决定的。

45. 9.9 Bacterial RNA polymerase has two modes of termination
11.25 原本的终止子具有形成发卡结构的回文结构，长度大约为7-20bp。这个茎状环包括一个富含G-C配对的区域和尾随着一个连串的U残基。在图11.25中，真实终止子有两个明显的结构特点：一个发卡的二级结构和在最末端的含大约6个u的片段。对终止事件，这两个结构都是必须的。它们之间普遍的距离是7-9个碱基。有的时候，这段片段被打断。
Intrinsic terminators have the two structural features evident in Figure 9.26: a hairpin in the secondary structure; and a run of ~6 U residues at the very end of the unit. Both features are needed for termination. The hairpin usually contains a GC-rich region near the base of the stem. The typical distance between the hairpin and the U-run is 7-9 bases. Sometimes the U-run is interrupted.
根据RNA聚合酶是否在体外需要其它因子，E.coli中的终止子分为：
（1）真实终止子：核心酶可以在体外在某些特定位置终止转录而不需要其它任何因子。这些位点就叫做真实终止了，反映了RNA聚合酶在这些位置上不需要任何辅助因子就可以终止转录的情况。
（2）Rho-依靠终止子：顾名思义，这些终止子在体外需要Rho因子的参与；并且变异显示在体内终止时，这个因子同样被涉及。
发卡结构是由穿插着短片短段的回纹序列碱基配对而形成的，发卡的长度是可变的，在接近基底部的区域经常是一段富含G.C的序列。
发卡基区域的点突变将会阻止终止的发卡。“发卡”对于转录的影响是什么？可能所有在RNA产物中产生的发卡引起在合成RNA过程中的RNA聚合酶移动变慢甚至暂停。
暂停给了终止一个发生的机会。在类似于终止子结构，但在发卡与u片段之间距离较大（通常10-11碱基）的位置会出现暂停。但是如果暂停的位点不是终止子，酶通常是会继续前进转录的。暂停的长短是不同的，通常在终止子的暂停持续60s左右。
当RNA聚合酶在发卡处暂停时，它右边的U片段引起它与模板的解离。在RNA-DNA杂合体中， rU·dA的碱基配对作用非常弱；在RNA-DNA杂合体双链解离中，它需要的能量最少。当RNA聚合酶暂停时，RNA-DNA杂合体在结合作用较弱的rU·dA终止区域打开。实际的终止经常在接近u或中段或其末端几个位点中的一个发生，好像酶在终止时口吃一样。
敲出这段U序列中的点以缩短它的长度所引发的结果证明了这段U序列的重要性。虽然酶仍然在发卡处暂停，它不再引起终止。这段U序列对应着富含A·T的DNA区域。因此，我们可以看到富含A·T的区域在真实结束及起始时都是重要的。
不论是发卡的序列，还是U片段的长度都影响着终止的效率。尽管如此，在体外终止的效率可能在2-90%之间变化，并且与发卡的组成和U单体的个数没有简单的相对应关系。因此，发卡结构和U片段是必须的，但仍不够，还有其它的因素影响了RNA聚合酶的作用。
暂停和终止与RNA聚合酶的不连续运动有关。（图11.7）一种可能性是这样的，当RNA聚合酶转录到暂停位置时被压缩，随后被释放为舒展的构型即可能与“逃跑”（继续伸长）有关，也可能与一种暂停的构型有关，最终继续转录或终止。
Figure 9.26 Intrinsic terminators include palindromic regions that form hairpins varying in length from 7-20 bp. The stem-loop structure includes a G-C-rich region and is followed by a run of U residues.

46. 9.10 How does rho factor work?
Polarity refers to the effect of a mutation in one gene in influencing the expression (at transcription or translation) of subsequent genes in the same transcription unit.

47. 9.10 How does rho factor work?
E. coli has relatively few rho-dependent terminators; most of the known rho-dependent terminators are found in phage genomes. The sequences required for rho-dependent termination are bases long and lie upstream of the terminator. Their common feature is that the RNA is rich in C residues and poor in G residues. An example is given in Figure 9.27; C is by far the most common base (41%) and G is the least common base (14%). As a general rule the efficiency of a rho-dependent terminator increases with the length of the C-rich/G-poor region.
当RNA聚合酶在体外用某些特定的转录单位为模板时，正确的终止并不能发生，聚合酶在终止子处暂停，然后继续合成RNA。Rho因子是一个蛋白质，它在体外系统的加入被发现可以使RNA聚合酶在特定的位点终止，生成唯一的分端，这个作用称为rho-依赖型终止。虽然基因组含有的rho-依赖型终止子数量相对较少，但rho是E.coli不可缺少的一种蛋白。绝大多数已知的rho-依赖型终止子在细菌病毒的基因组中被发现。
11.26 一个依靠rho终止子有一个富含C但含G很少的序列，它处在最终终止的位点之前。
Rho-依赖型终止需要在终止子的上游有一个长度为50-90个碱基的序列。它们共同的特点是含有较多的C和较少的G单体。图11.26给出了一个例子。到目前为止，C是最普遍的碱基（41%）而G是最少出现的（14%）。Rho-依赖型终止的效率随着多C少G区域长度的增加而增长，这是一个基本的法则。
对于真核聚合酶终止时所涉及的信号及辅助因子知道得就更少了。每一类聚合酶使用一种不同的机制。（见28章）不过，适用于细菌RNA聚合酶真实结束过程中的特点也同样适用于真核细胞，二级结构和（或）U片段在转录过程中是重要的。
Figure 9.27 A rho-dependent terminator has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s) of termination.

48. 9.10 How does rho factor work?
Figure 9.28 Rho factor pursues RNA polymerase along the RNA and can cause termination when it catches the enzyme pausing at a rho-dependent terminator.
Does rho factor act via recognizing DNA, RNA, or RNA polymerase? Rho has an ATPase activity, which is RNA-dependent and requires the presence of a polyribonucleotide, >50 or so bases long. This suggests that rho binds RNA. Probably an individual rho factor acts processively on a single RNA substrate. The "hot pursuit" model for rho action shown in Figure 9.28 supposes that it binds to a nascent RNA chain at some point upstream of the terminator. This might require a specific sequence or type of sequence, or attachment could occur just at a free 5 end or some other exposed sequence. Rho then translocates along the mRNA.
九、Rho因子是如何起作用的？
Rho因子只在终止阶段起作用。它是一个大约46KD的蛋白质，大概只在六聚体的形式中具有活性。它作用RNA聚合酶的一个辅助因子起作用，在体外，当它的浓度达到RNA聚合酶的浓度的1/10时，通常活性最大。
Rho因子是通过辨认DNA，RNA或是RNA聚合酶而起作用的吗？
11.27 rho因子沿RNA跟随RNA聚合酶，当聚合酶在一个依靠rho的终止子停下时，它就引起终止。
Rho有ATD酶的作用，其依赖于RNA并且需要一个250碱基左右的多核苷酸链。这也就是说rho与RNA结合，可能是每一个独立的rho因子在单链RNA底物上移动地起作用。图11.27显示了rho起作用“热点追踪”模型。它假设Rho在终止子上游的某点与新合成RNA结合时，尽管只能发生在自由 端或某些暴露的序列中，仍然需要某个或某种特殊的序列，然后Rho沿着mRNA移动。
Rho是怎样赶上RNA聚合酶的呢？一种可能性是rho沿转录体的速度比RNA聚合酶沿DNA移动的速度要快。当酶遇到终止子暂停时，如果rho赶上了它，终止就会发生。
Rho是直接作用于DNA-RNA联体从而释放转录体还是间接地使RNA聚合酶释放RNA的呢？在RNA聚合酶缺省的条件下，rho具有使RNA-DNA杂合体分解的从5′端到3′端的解螺旋作用；ATP水解用以给这个反应供应能量。
Rho沿RNA移动的观点导致了转录与翻译关系的一个重要预测。Rho必须首先接近并进行一个结合序列（在RNA上），然后必须能够沿着它移动。如果核糖体正在翻译一个RNA，前两者情况或者至少有一种情况将被阻止。就这样，rho因子在终止了赶上酶的能力就取决于翻译过程中发生了什么。

49. 9.10 How does rho factor work?
Figure 9.29 The action of rho factor may create a link between transcription and translation when a rho-dependent terminator lies soon after a nonsense mutation.
这相模型假释了一种奇怪的现象。在有些情况下，一个转录单位中一个无意义的突变将会阻碍此单位中后面基因的表达。这种效果叫做极化，一个共同的后果是对应于此单位中后面基因的信使RNA缺省。
11.28 rho因子的运动当在一个无意义突变后紧随着一个依靠rho终止子时，可能创造一个连接。
假定在转录单位之中有一些rho-依赖性终止子，也就是说，终止子之前的基因经常被用到。图11.28描述了它的后果，通常情况下，由于核糖体阻止了rho接触RNA聚合酶，这些早期的终止子没有用到。但当一个点突变释放了核糖体时，rho可以自由地接近并且（或）沿着mRNA移动，在终止子处对RNA聚合酶起作用。因此，酶被释放而转录单位中的无期基因不再被表达。（为什么会有内置终止子？或许是简单地原为它们的序列碰巧与一般的rho-依赖性终止子较像）。一些稳定的RNA具有大量二级结构，会避免极化现象的产生。可以想象是因为这些二级结构阻止了rho的进攻或移动。
rho变异在对终止事件的影响上显示了很大的差异。这个效果的基本性质是终止失败。但是失败的程度，以在体外通读的百分率表示，依赖于特定的靶位，同样，在体外对rho因子的需求也不同。有些（rho-依赖性）终止子需要相对较高浓度的rho ，而其它则在低浓度下也能起作用。这就告诉我们不同的终止子在终止时对rho因子的需求程度不同，因此对变异体中残存的rho因子的响应程度不同。（rho变异体经常有遗漏）。
rho变异经常抑制了极化。它们降低了rho将与无意义变异后的终止子作用的可能性解释了这一现象。翻译的停止并不能引起转录的停止，并且信使RNA中突变后区域能被重新作用的核糖体翻译。
其它基因的突变可以越过rho突变。这种方法可以认出与rho作用的蛋白质。RNA聚合酶的β链与两种突变有联系。首先，rpoB基因的突变减少了在rho-依赖性位点的终止。然后，rpoB的突变可以恢复rho变异细菌在rho-依赖性位点终止转录的能力。

50. 9.11 Antitermination depends on specific sites
Antitermination proteins allow RNA polymerase to transcribe through certain terminator sites.

51. 9.11 Antitermination depends on specific sites
Figure 9.30 Antitermination can be used to control transcription by determining whether RNA polymerase terminates or reads through a particular terminator into the following region.
Antitermination is used as a control mechanism in both phage regulatory circuits and bacterial operons. Figure 9.30 shows that antitermination controls the ability of the enzyme to read past a terminator into genes lying beyond. In the example shown in the figure, the antitermination factor regulates the expression of region 2.
十、特殊位点的抗终止作用
11.29 反终止作用可以决定RNA聚合酶是终止或是穿过一个特别的终止子进入下一个区域，它就是这样来控制转录。
抗终止作用在病毒调控周期和细菌操纵子中都是一种调控机制。图11.29显示了抗终止作用控制酶越过终止子阅读后面基因的能力。在图中所示的例子中，抗终止作用基因2的表达是正调控。

52. 9.11 Antitermination depends on specific sites
11.30 转录特异性开关可以在起始和终止被控制。
Antitermination was discovered in bacteriophage infections. A common feature in the control of phage infection is that very few of the phage genes (the "early" genes) can be transcribed by the bacterial host RNA polymerase. Among these genes, however, are regulator(s) whose product(s) allow the next set of phage genes to be expressed. Two common types of action for such a regulator protein are to sponsor initiation at new (phage) promoters or to cause the host polymerase to read through phage terminators. Figure 9.31 compares the use of new promoters as a control mechanism with the use of antitermination.
抗终止作用是在细菌病毒侵染周期中发现的。控制病毒侵染的一个重要的特点是病毒基因中极少量能被宿主酶转录。尽管如此，在这些基因中仍有能表达下一组病毒基因的调控子基因。这样一种调控子蛋白质的作用有两种基本类型，启动病毒新的启动子或使RNA聚合酶越过终止子。图11.30比较了利用新启动子和抗终止作用的两个控制机制。
辩识新的病毒起动子的机制是用指导酶起始特异性的一种新的Sigma因子替换原有宿主Sigma因子。（见图11.22 和11.24）还有一种办法是合成新的病毒RNA聚合酶。任一种情况都是通过与被原始宿主RNA聚合酶所辩认的启动子不同的新的启动子而辩认区分一组新的基因。两组基因的转录是独立的，因此在新的Sigma 因子或新的酶被合成之后，早期基因的表达就停止了。
抗终止作用提供了病毒控制从早期因基到下一期基因表达转变的另一种机制。抗终止作用的使用依赖于基因位置的特殊安排。早期基因与接下来要表达的基因非常接近，但由终止子隔开。如果终止子在这些位点被抑制，聚合酶就会越过，读另一边的基因。这样在抗终止作用时，同样的启动子继续被RNA聚合酶识别。这样新基因的表达只在于伸长RNA链，使之在5′端含有早期基因，在3′端含有新的基因。由于两种类型的序列是连着的，早期基因的表达不可避免地继续。
在Lambda中，发现了抗终止的现象，它也提供了这种现象的一个最好的例子。宿主RNA聚合酶起初翻译了两个被称为“即刻早期基因”的基因。阻碍即刻早期基因的终止控制了向下一阶段表达的转变，即表达“延迟早期基因。”（我们将在下一章中讨论lambda生长总体控制的细节）。
由于lambda N基因上的突变导致只能转录“即刻早期基因”，所以N基因控制了从“即刻早期基因”到“延迟早期基因”的转变。当SPOI病毒的基因28发生突变而没有gp28产物时，会发生同样的现象。从基因的观点看，新起始和抗终止的作用机理是相似的，都是正控制，即病毒必须先合成早期基因的产物，然后才能表达下一组基因。
Figure 9.31 Switches in transcriptional specificity can be controlled at initiation or termination.

53. 9.11 Antitermination depends on specific sites
One mechanism for recognizing new phage promoters is to replace the sigma factor of the host enzyme with another factor that redirects its specificity in initiation (see Figure 9.22 and 9.24). An alternative mechanism is to synthesize a new phage RNA polymerase. In either case, the critical feature that distinguishes the new set of genes is their possession of different promoters from those originally recognized by host RNA polymerase. The two sets of transcripts are independent; as a consequence, early gene expression can cease after the new sigma factor or polymerase has been produced.
Figure 9.22 Sporulation involves the differentiation of a vegetative bacterium into a mother cell that is lysed and a spore that is released.

54. 9.11 Antitermination depends on specific sites
11.31 大量RNA聚合酶转录λ基因并在t座位终止。PN使它可以穿过在L和R1单元内的终止子；PQ使其可以穿过R’终止子。PN和PQ所作用的位点是在转录单元的不同联系位置上。
抗终止是lambda病毒用以控制跃出早期阶段的一种机制。如图11.31。两个即刻早期基因的转录单位分别起始于起动子PL和PR，E.coliRNA酶控制的转录分别自动停止于终止子tL1和tR1。两个终止子都依赖于rho，实际上，rho就是在这两个终止子上发现的。N基因的表达引起了情况的改变。产物PN是一个抗终止蛋白质，使得RNA聚合酶越过tL1和tR1阅读后面的延迟早期基因。
像其它病毒一样，编码病毒成份的晚期基因仍需要其它的调控机制。基因Q控制了这个转变，它本身是延迟早期基因。它的产物PQ是另一个抗终止蛋白质，特异地使起始于起动子PR的RNA聚合酶越过终止子阅读下一段基因。这样利用不同特异性的抗终止蛋白质，指导着基因表达的联级反应。
PN和PQ不同的特异性建立了一个重要的基本原则：一个辅助因子可以特异地给RNA聚合酶对于某些转录体抗终止作用。控制终止和挖制起始有同等的精确性。什么位点涉及了对终止特异性的控制？
PN的抗终止作用是高度特异性的，但是抗 终止事件并不是由终止子tL1和tR1决定的；抗终止作用的识别位点在转录单位的上游，也就是在不同子作用完成的终止子位点的其它区域。这个结论建立了一个基本原则。当我们知道蛋白质对DNA起作用的位点时，并不能想当然的认为这也碰巧是DNA识别序列。它们也许是分开的。
Figure 9.32 Host RNA polymerase transcribes lambda genes and terminates at t sites. pN allows it to read through terminators in the L and R1 units; pQ allows it to read through the R￠ terminator. The sites at which pN acts (nut) and at which pQ acts (qut) are located at different relative positions in the transcription units.

55. 9.11 Antitermination depends on specific sites
How does antitermination occur? When pN recognizes the nut site, it must act on RNA polymerase to ensure that the enzyme can no longer respond to the terminator. The variable locations of the nut sites indicate that this event is linked neither to initiation nor to termination, but can occur to RNA polymerase as it elongates the RNA chain past the nut site. As illustrated in Figure 9.33, the polymerase then becomes a juggernaut that continues past the terminator, heedless of its signal. (This reaction involves antitermination at rho-dependent terminators, but pN also suppresses termination at intrinsic terminators.)
PN的识别位点叫做nut (for N utilization)。这些位点分别决定向左或向右抗终止作用，分别被叫做nutL和nutR。Nut变异画图得出nut的位点在PL的起始点和N编码区域的开始之间；而nutR位于cro基因的末端和tu之间。这就意味着这两个nut位点位于相同于转录单位结构不同的位置上。nutL接近于起始子，而nutR接近于终止子。（qut也不相同，位于起始子之前）。
11.32 一些辅助因子在RNA聚合酶通过某些位点是结合在DNA上。Nut位点有两个序列构成。NusB-S10结合核心酶。当聚合酶通过boxB时，NusA和PN蛋白结合上酶。PN因子的存在使聚合酶穿过终止子，产生一个由immediate early序列连结delayed early序列的连结Mrna.
抗终止作用是怎样产生的呢？当PN识别nut位点后，它必然作用于RNA聚合酶，使之不再对终止子起响应。不同的nut位点说明这个事件与起始和终止均没关系，但是能作用于经过nut位点延去RNA链的RNA聚合酶。如图11.32所示，聚合酶不理会终止子的信号，越过终止子，成为专制合成酶。（这个作用涉及rho-依赖性终止子的抗终止，但是PN也可抑制真实终止子的抗终止作用。）
PN识别一个短序列的能力是否是一种更广泛使用的抗终止的机制的代表？其它与lambda相关的病毒有不同的N基因及不同的特异性。在这些病毒之中，基因组中nut位点序列不同，因而具有能被自身PN识别的特异结构。任一PN产物都有抗终止转录机构的基本特性，但是其特殊作用的能激活该机制的DNA序列不同。
Figure 9.33 Ancillary factors bind to RNA polymerase as it passes certain sites. The nut site consists of two sequences. NusB-S10 join core enzyme as it passes boxA. Then NusA and pN protein bind as polymerase passes boxB. The presence of pN allows the enzyme to read through the terminator, producing a joint mRNA that contains immediate early sequences joined to delayed early sequences.

56. 9.12 More subunits for RNA polymerase
终止与抗终止作用是紧密联系的，并且涉及对某些转录单位中某些序列响应的与RNA核心酶相作用的细菌或病毒蛋白质。一个lambdanus位点由boxA与boxB两个序列单元组成。细菌操纵子中也发现了相似于boxA的序列单元。在病毒及细菌操纵子中，boxA负责结合抗终止作用中必须的细菌蛋白。boxB是病毒基因组所特有的，它的变异会使PN丧失引起抗终止作用的能力。
抗终止作用被发现作为一个病毒控制机制导致了进一步转录机构成份的发现。分离PN无效的E.coli变异性体可以发现与PN反应的细菌蛋白质。lambda病毒不能成功地侵染细菌变异体，因为它被限制而只能表达即刻早期基因。有几个这样的突变位于rpob基因，这说明PN（像rho因子一样）与核心酶的β亚基反应。
基佗的E.coli变异指示了nus位点：nusA, nusB, nusE和nusG。（nus是N利用物质的缩写）。nus位点编码了构成部分转录机构的蛋白质，并且它们在通常情况下与RNA聚合酶有联系。nusA, nusB和nusG的作用只与转录的终止有关。nusE编码S10核糖体蛋白质，在终止过程中它在30s小亚基中的位置与作用的关系还不清楚。nus A是一个基本的转录因子，大概是由于它增大了RNA聚合酶在终止了暂停的趋势（实际上也在其它二级结构处，见下述），从而增大了终止的效率。NusB和S10组成了与含有60×A序列的RNA特异结合的双聚体。nusG可能与所有的nus因子与RNA聚合酶最终结合成复合体有关。Nus起作用的要求是不同的，对PN来说，nusA足够使它阻它在真实终止子的终止过程；而对于PN在rho-依赖性终止子起作用，4种nus因子都是必须的。
抗终止作用E.coli中的nus(rRNA)操纵子中发生，并且也涉及同样的nus作用。nrh的指导区域含有bosA序列；NusB-S10双聚体识别这些序列并且当伸长的RNA聚合酶经过此处时与之结合。这样就改变了RNA聚合酶的性质，使之读过转录单位中的rho-依赖性终止子。
lambda RNA中的boxA序列并不与NusB-S10结合，可能只有在nusA和PN的存在下才会与之结合；boxB序列可能用来稳定这个作用。这样boxA序列中的变异可以测出哪些特定的因子组在抗终止作用时是必须的。效果是同样的：当RNA聚经过nut位点，它与某些特点的因子结合，从而被修饰，当它之后遇到终止子序列时，终止会失败。
11.33 RNA聚合酶可能在起始态和终止态之间变换，同时σ和Nus因子交替占据在核心酶上的位置。
Figure 9.34 RNA polymerase may alternate between initiation-competent and termination-competent forms as sigma and Nus factors alternatively replace one another on the core enzyme.

57. 9.12 More subunits for RNA polymerase
nusA与核心酶结合，但并不与全酶发生作用。当Sigma因子加入到 复合体中，它代替了nusA蛋白质，重新组成了 全酶。这也就是说RNA酶以准备起始和准备终止的交替形式存在，经历了如图11.33所示的循环。当全酶（ ）与起动子结合后，释放了Sigma因子，产生了核心酶（ ）来合成RNA，当一个nusA蛋白质辩识了核心酶并与之结合，就产生了 复合物。当 聚合酶与DNA结合时，nus成分不能被替换。当发生终止时，酶被释放，nus因子或者被释放，或者被sigma因子所取代。
在起始时sigma因子结合在终止时与nus因子结合，核心酶以这两种形式交替地存在。Sigma因子与nus因子在与核心酶的结合上互相不兼容，认为它俩之中的一个是超过另一个的成份是没有道理的，我们只能把它们当作交替的亚基。这样核心酶构成了RNA聚合酶的最简形式，在缺省其它功能所必须的亚基情况下，可从事RNA合成的基本功能。RNA聚合酶在什么地方结束以及更广泛合成机构在什么地方开始仍存有争议。
在抗终止作用时，PN与RNA聚合酶结俣的方式依赖于转录单位的序列。PN是识别DNA上的boxB位点，还是RNA上的BoxB位点呢？它并不是直接与这两种序列结合的，而是与当核心酶经过60×B位点时所形成的转录复合体相结合。也许它识别的是60×B的RNA序列，但在结合时需要与RNA聚合酶发生蛋白质-蛋白质作用。在加入转录复合体之后，仍然与核心酶结合，是改变对终止子识别的附加亚基。事实上，PN可能继续和bo×B的RNA序列和RNA聚合酶相结合，保持RNA上形成一个，这样bo×BRNA的作用部分是将PN拴在附近，有效地增大它的局部浓度。
NusA是转录复合体上与PN结合的部分。可以得到N的变异消除由nusA变异所导致的抗终止作用的阻断；并在体外两个蛋白质仍然可以结合。NusA和PN可能是非常快速而边疆地结合到转录复合体上。事实上，除非有包括nusA在内的宿主蛋白质的存在，否则PN不能与RNA聚合酶起作用。
PN的抗终止作用是什么？它起作用可能是阻止RNA聚合酶暂停，从而不给rho因子引起暂停的机会，或者它是通过消除rho释放新合成RNA转录体的能力而起作用的。实际上，PN有抗暂停作用，它是否对rho因子起作用仍不清楚。
Figure 9.34 RNA polymerase may alternate between initiation-competent and termination-competent forms as sigma and Nus factors alternatively replace one another on the core enzyme.

58. 9.12 More subunits for RNA polymerase
PQ通过在qut位点起作用，而阻止之后的病毒侵染中的终止。qut序列位于后期转录单位的起点。它的前部分位于起动子之中，后部分在被转录部分的开始。这暗示了PQ起作用与DNA的识别是联系着的，并且它作用的机理，至少涉及最初结合复合体，一定与PN不同。
PQ的基本作用是干扰暂停；并且一旦PQ对RNA聚合酶起作用，酶在包括rho-依赖性和真实终止子在内的所有位点处的暂停将缩短。这样，PQ没有直接作用于终止子本身，而是让酶声速通过终止子，使核心酶和（或）辅助因子没有机会引起终止。
我们并不理解不同操纵子上终止过程的细微差别，例如，nusB-S10对rrn操纵子有抗终止能力，而lambda则需要RN。由于在终止和抗终止过程中涉及的蛋白质以复合体的形式起作用修饰RNA聚合酶的行为，它们独立的作用往往显得似非而是；因此,nusA被发现是PN抗终止过程中所需要的一个因子，而它本身却涉及终止作用。
基本的原则是RNA聚梧酶以不同的形式存在，承担不同转录阶段的特殊任务，并且它在这些阶段的作用是通过对适应形式的修饰来改变的。因而对Sigma因子的替代使可起始形式转化为其它形式；并且nus因子的加入可改变可终止形式的性质。
抗终止作用的特异性是由使抗终止因子定位的序列（lambda中nut或qut）来决定的；这些因子一旦被定位，即使遇到了终止子，终止作用也会或多或少地被抑制。可能存在抗性终止子使具有抗终止因子的RNA聚合酶发生终止。
终止作用似乎是不可避免地伸长方式有联系。在基本的转录方式中，核心酶在伸长过程中会出现许多暂停；并且在终止子位点的暂停是引起终止的先决条件。在诸如nusA等因子的影响下，暂停将会被延长，增加终止的效率。而在PN或PQ的影响下，暂停会缩短，减少终止效率。由于只在特定的操纵子中发现了这些因子的辩认位点，因而只有在这些操纵子中的暂停和终止才会被改变。
Figure 9.34 RNA polymerase may alternate between initiation-competent and termination-competent forms as sigma and Nus factors alternatively replace one another on the core enzyme.

59. Summary
1. A transcription unit comprises the DNA between a promoter, where transcription initiates, and a terminator, where it ends. 2. Core enzyme has a general affinity for DNA. 3. Bacterial promoters are identified by two short conserved sequences centered at 35 and 10 relative to the startpoint. 4. The binary complex is converted to a ternary complex by the incorporation of ribonucleotide precursors. 5. The "strength" of a promoter describes the frequency at which RNA polymerase initiates transcription.
十二、总结
DNA上从起始转录的起动子到终止转录的转录子之间组成了转录单位。这个区域之中的一条链作为合成互补RNA的械板。当转录泡沿着DNA移动时，RNA-DNA融合区域非常短（2-3个DP），瞬间存在。合成细菌RNA的DNA全聚合酶分为两部分。核心酶是负责延长RNA链的复合结构。Sigma因子是起始阶段辩认起动子所必须的一个单一亚基。
核心酶对DNA一般有亲合性。加入sigma因子后，酶对DNA的非特异结合亲合性会降低，但是会增大它对起努子的亲合性。RNA聚合酶找到起动子的速度很快，因此不能解释为扩散和随机作用；酶所携带的DNA序列会被直接交换。
细菌起动子被证明是 相对于起始点位置为-35和-10两点为中心的保护短序列。绝大多数的启动子在这些区域的序列与契合序列符合较好。契合序列之间的距离为16-18bp。RNA聚合酶最初在-35序列“抛锚”，然后扩大它的作用，与-10区域反应。酶盖DNA上大约77个bp。从-10区域到起始点这段12bp序列被熔化，使起初的闭合双链复合体变为开放双链复合体。-10区域的高A·T碱基对成份可能对熔化作用很重要。
在引入核糖体前体后，双复合物变成了三复合物。在许多失败起始的复杂过程中，RNA聚合酶并不离开起动子，只是合成并释放2-9个碱基的链。在这个阶段的最后，Sigma 因子被释放，核心酶减少到只覆盖50bp，然后核心酶在DNA上移动，合成RNA。DNA的局部解旋区域随着酶一起移动。当新链达到15-20个核苷酸长度时，酶作用的区域进一步变小，只覆盖30-40bp，然它继续直至转录单位的结束。
酶以英寸虫机理不均匀前移，前部保持不变，而后部每次前移一个bp：7-8个bp之后，前部也被释放。在辅助因子的参与下，酶可以通过断裂RNA链而从被捕获复合物形式恢复到具有重新起始能力的形式。当遇到终止子时，RNA聚合酶及RNA均被释放，DNA则完全恢复为双螺旋结构。
起动子的力量描述了RNA聚合酶起动转录的频率，它与-35序列与-10序列的距离与理想契合序列间距离的符合程度有关，也受起始点后面序列的影响。负超螺旋将加强特点起动子的力量。转录在RNA聚合酶前引起正超螺旋，在其后负超螺旋。

60. Summary
6. The core enzyme can be directed to recognize promoters with different consensus sequences by alternative sigma factors. 7. The geometry of RNA polymerase-promoter recognition is similar for holoenzymes containing all sigma factors. 8. Bacterial RNA polymerase terminates transcription at two types of sites. Intrinsic terminators contain a GC-rich hairpin followed by a run of U residues. 9. The Nus factors increase the efficiency of rho-dependent termination, and provide the means by which antitermination factors act Antitermination is used by some phages to regulate progression from one stage of gene expression to the next and (less often) in bacteria.
在不同Sigma因子的指导下，核心酶可以识别不同契合序列的起动子。在E.coli中，这样的sigma因子被不同的条件，振动或N缺乏，所激活。B.subtili具有E.coli sigma 因子相同的特异性的一个单一主要sigma因子，但也仍然存在共它次要sigma因子。当芽孢生长开始时，会激活另一系列的因子；芽孢生长被前孢子和亲代室细胞中sigma因子替换的两上联级反应所控制。SPO1病毒在调控转录时用到相似的机制。
除去包含σ54sigma因子的全酶在聚合酶一启动子识别的几何特点是相似的。第一种sigma 因子引起RNA聚俣酶在-35和-10的特殊契合序列处启动转录。已经发现E.coliσ70因子与这些位点的直接结合。sigma 因子所引起结合作用与核心酶所引起的结合作用的关系尚不清楚。涉及使sigma因子替换机制本质的sigma因子应用问题仍没有答案。
细菌RNA聚合酶在两种位点结束转录。真实终止子中富含G·C发卡后有一段U片段。在体外，它们可以被核心酶独立辨认。Rho-依赖性结束子在体外和体内都需要rho因子；在这些终止子之前有一段多C少G的50-90核苷酸片段。Rho作少一种附加终止因子是一种必不可少的蛋白质，它辩认RNA并作用于RNA聚合酶暂停的位点，终止活动需要ATP水解。
nus因子增加了rho-依赖终止的效率，并且为抗终止因子起作用提供了途径。NusB-S10双聚体辩认了60×A序列在延长RNA中，nusA随后加入。nusA与起始Sigma因子在与核心酶结合时互相排斥。
噬菌体利用抗终止作用调控基因表达从一个阶段到下一个阶段，细菌中就较少出现。lambdaN基因编码使RNA 聚合酶读过即刻早期基因末尾终止子所必须的蛋白质PN。另一种抗终止蛋白在以后的病毒侵染中被用到，PQ。当RNA聚合酶经过nut和qut位点时，PN和PQ分别作用于基个。这些位点位于转录单位中不同的相对位点。载有nusA的RNA聚合酶经过60×B序列时PN可以识别。然后PN与复合体结合并当聚合酶遇到rho-依赖性终止子时，防止终止。