1. Protein protein interactions

2. Better understanding of protein b’s function
Introduction
Protein a
known
Protein b
unknown
Interaction
Better understanding of protein b’s function

3. Introduction Protein a Protein b
Function a
Protein b
Function b
Interaction
Detecting relationship between pathways
Detecting new pathways
ובסופו של דבר כמובן להבנה טובה יותר של היצור

4. Comprehensive methods
Old world vs. new world
OLD WORLD
Discrete methods (1 X 1)
MAINLY
IN THIS LECTURE
ובסופו של דבר כמובן להבנה טובה יותר של היצור
NEW WORLD
Comprehensive methods

5. Yeast two hybrid system
Simple transcription AD
AD = Activation Domain
DBD
DBD = DNA Binding Domain
Transcription
Complex
UAS- upstream activating sequence
transcription
gene
upstream activating sequence
UAS

6. Yeast two hybrid system
Hybrid proteins
DBD
bait AD
fish

7. Yeast two hybrid system
Hybrid proteins AD
fish
Transcription
Complex
DBD
bait
transcription
Reporter gene
UAS

8. Yeast two hybrid system
plasmids
Plasmid A
promoter
DBD
bait
Plasmid B
promoter AD
fish
כמו כן הם מכילים גני סלקציה שונים
Yeast

9. Yeast two hybrid system
plasmids
Report of the gene only in case of interaction
Between the two proteins
הרבה פעמים הגן המדווח הוא מצע סלקטיבי
Yeast

10. Yeast array – producing the array
A comprehensive analysis of protein-protein interactions in S. cerevisiae
P. Uetz et al..
ORF – Open Reading Frames
Produce the yeast’s 6000 ORFs
promoter AD
ORF
Produce plasmids: each contains ORF + AD
Transformation the plasmids into yeast cells
Yeast
2 colonies of each transformation are
inserted to the array
2 השיטות הבאות מסתמכות על Yeast 2 hybrid system
כמובן שכל הזמן יש סלקציות – בפלסמיד, בשמרים וכו‘
ההבדל ממקודם: רק AD לשמר וגם כל ה-ORFs

11. Yeast array – producing the array
ORF of protein y+ AD
ORF of protein x+ AD

12. Yeast array – using the array
Selection of 192 “easy” proteins
promoter
DBD
ORF
Producing similar plasmids (DBD+protein)
Transformation the plasmids into yeast cells
Yeast
MATING & creating
diploids
SELECTION OF
LIVING COLONIES
BASED ON HIS3
PRODUCTION
DETECTING THE
ARRAY’S PROTEIN
ACCORDING TO ITS
POSITION
החלבונים נבדקים על פי פוטנציאל התקשרות
בכל פעם הפגשת שמר DBD אחר עם החלבון

13. Yeast array - results BEFORE (Pcf11) AFTER RNA14 RNA15
למעלה – ה-chip כפי שהוא נראה לפני ביצוע שפיכת החלבון – הצ'יפ נמצא על מצע המאפשר גידול כל הטרנספורמטים
למטה – לאחר שפיכת חלבון Pcp11 שהוא חלק מקומפלקס IA שאחראי לחיתוך ופולאדנילציה של פרה-mRNA.
הנקודות הן המושבות שמייצגות חלבונים שבאים עימו במגע, המצע סלקטיבי ל.HIS
אותר קשר עם חלבונים כמו RNA14, RNA15 שהם גם חלק מהקומפלקס (מסומנים).
RNA15

14. Yeast array - Results over-view
2 undependable assays were preformed for each of the 192 proteins.
87 out of 192 proteins were detected as involved in protein-protein interactions (passed the 2 assays)
total of 281 interactions were detected

15. Activation Domain library
promoter AD
ORF
Production of ORF+AD plasmids and transformants
promoter
DBD
ORF
Production of ORF+DBD plasmids and transformants
Production of an AD library
Duplicates of a single DBD transformant
הכנת היברידים – בדומה להיברידים מהשיטה הקודמת
בכל פעם – הכנסת טרנספורמנט DBD אחד
PCR + ריצוף
MATING (haploids to diploids)
The AD library
Transferring to a selection plate
Detecting the ORF’s using PCR

16. Activation Domain library - results
817 out of ~6000 proteins were detected as involved in protein-protein interactions
total of 692 interactions were detected
כמה פעמים באותו ניסוי:
קשר של חלבון למוטיב חלבוני שחוזר בכמה חלבונים (קינאז גינרי וכו')
דופלקציות של גנים בחלבון (DNA שנע וכו')

17. Array vs. library - Comparison CONCLUSIONS - THE METHODS’
Rather quick
Takes a lot of time
Time
Huge number
(6000X6000)
Plenty
(192X6000)
Amount of checked
interactions
1.8
3.3
Average number of
Interactions for an interacting protein 14 48
Number of interactions of 12 proteins that were detected in both methods
CONCLUSIONS - THE METHODS’
QUALITIES
SENSETIVE, BETTER RESULTS
QUICK, SIMPLER, CHEAPER

18. Protein arrays – producing the array
Protein chips: from concept to practice
Young-Sam Lee et al..
Producing the yeast’s 6000 ORF’s using plasmids
Attaching histidine anchors to every protein
Attaching the proteins to an array
אולי לשים בהתחלה
ORF – מקטע DNA – מחפשים מתאונין + stop coddon - פוטנציאלי שיש שם חלבון
שתי שיטות:
A – חלבונים שונים, כל אחד מקופל היטב
B – אותו החלבון בקיפולים שונים אוריינטציות שונות ורמות דנטורציה שונות

19. Protein arrays – using the array
Pouring a protein onto the array
Detecting the interactions
The poured
Protein
is labeled
Sophisticated
assays
Using antibodies
that detect the
interaction’s product
מציאת האינטרקציות על פי מיקום החלבון במערך
סימון רדיואקטיבי או פלואורסנטי
נוגדנים כנגד תוצר הפעילות המשותפת של החלבונים – למשל חלבון א' מזרחן את ב' והנוגדן מזהה את תוצר הזרחון הספציפי
שיטות מתוחכמות – חלקן עוד בבדיקה: לייזר שמזהה שינויים במאסה, ספקטרומטר ועוד

20. Mass Spectrometry of purified complexes
Production of chimeric tagged proteins using plasmids
The protein creates a complex of proteins
The complex is isolated using the tag
The complex is separated using gel
electrophoresis
Each protein is identified by Mass Spectrometry

21. Mass Spectrometry of purified complexes
BENEFITS
Identifying complex interactions
Reliability can be checked
DRAWBACKS
Needs specific conditions
Can lose loosely associated components
Tagging might disturb the “complexing”
בדיקת אמינות – משתמשים במספר חלבונים מזוהים כקשורים באותו הקומפלקס
תנאים- בתנאים לא מדויקים לא יווצרו קומפלקסים

22. Synthetic Lethal Mutations What’s lethal mutation?
and mutants
Examine 2 genes , “viable”
Examining the creature carrying them
LIVES
LIVES
LIVES
DEAD
GENES
PR’ LEVELS
THE
CREATURE

23. Synthetic Lethal Mutations
Hypothesis : these proteins are in interactions
METHOD # 1: Synthetic Lethal Mutations
Create an artificial DNA containing 2 genes with conditional mutations
Change the conditions and detecting dead creatures
METHOD # 2: Synthetic Lethal Mutations Arrays
Create a yeast array, every yeast contains a different mutation
Pour different yeasts carrying different mutations
CONDITIONAL MUTATIONS – הכוונה למוטציות שבאות לידי ביטוי בתנאים מסוימים, בד"כ חום.קור
MATING & creating
diploids
STIMULATING THE
CREATION OF SPORES
+ SELECTION
FINDING THE DEAD

24. Computational methods
Mentioned in this seminar, mainly for understanding proteins’
Functions and using to detect interactions
Correlated mRNA expression
Measuring mRNA levels under a variety of cellular conditions
Grouping the genes that have similar transcriptional responses
מדידת mRNA: PCR, הרצת אלקטרופורזה ((northern
IN VIVO, EXAMINE DIFFERENT CELL’S CONDITIONS
NOT SO ACCURATE

25. Computational methods Genome analysis – IN SILICO
Prokaryotic's operons
Genes that are consistently in the same operon, in the same order but in different and distanced creatures
CREATURE A
CREATURE B
ORTHOLOGS
2/3 – 5/6 באמת באינטרקציה !
ניתן להבין שיש באמת קשרים בין הצהוב, הכחול והירוק

26. Computational methods
Genome analysis
Phylogenetic profile
Interacting proteins have a tendency to be either present ot absent
together from fully sequenced genomes
Gene fusion
(ROSETTA STONE)
פילוגנטי – כשליש הצלחה (באמת אינטרקציות)
איחוי – כ שני שליש הצלחה
One gene in creature A = some genes in creature B
CREATURE A
CREATURE B
1 polypeptid
3 polypeptids
HOMOLOGY

27. Computational methods
Genome analysis
Inexpensive, fast, “widened” with the genomes DB
Otology relationships are not so clear,
not always reliable