1. 9 ème symposium national du réseau Inserm de Recherche sur la Douleur Bordeaux
22-23 mars 2013
From the Poplar mecano-perception to visceral sensitivity in mice: role of ubiquitous transcription factor EGR-4?
Alison Accarie / 2ème année de thèse
Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny
Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid
UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur 1

2. Introduction
U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur
 inadequate support of chronic pain
Visceral pain
Abdominal pain
Colonic pain
First cause for gastroenterological consultation
Common symptoms of IBS et IBD (period of remission)
IBS : irritable bowel syndrome
IBD : intestinal bowel desease

3. Introduction Treatment only for symptoms No real efficacity
need therapeutic innovation
exploration of associated factors such as hypersensitivity

4. Colonic hypersensitivity
Introduction
Colonic pain
2/3 of cases
Colonic hypersensitivity
Exarcerbated response to painful stimulation or not
Peripheral sensitization (target organ)
Dans les douleurs colique on retrouve dans 2/3 des cas une hypersensibilité colique qui peut se definir comme étant une réponse exacerbé à un stimulus douloureux ou non ou par une sensibilisation de l’organe cible. Elle a un origine mécanique puisqu’elle est décrite dans les phénomène de compression d’organe ou de distension. Pour percevoir cette hypersensibilité il existent différent senseurs. 4

5. Introduction Colonic Hypersensitivity Different peripheral sensors
Central integration

6. Colonic mechanosensitivity: implication of ions channels
Introduction
Colonic mechanosensitivity: implication of ions channels
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis.
La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 6

7. Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Introduction
Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
ASICs
ASICs
Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis.
La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 7

8. Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Introduction
Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
TRPV
Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis.
La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 8

9. Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Introduction
Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
TRPA1
Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis.
La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes. 9

10. Peripheral sensors? Not clearly defined
Introduction
Colonic mechanosensitivity: implication of ionic channels
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
Comme les canaux …. Cependant la mecanoperception n’est pas leurs principale fonction pour les canaux…. Pour l’instant pas de mecanosenseurs vraiment etablis.
La mécano perception est une sensation commune a tous les animaux mais aussi aux plantes.
Peripheral sensors? Not clearly defined 10

11. Introduction Mecanoperception shared sensation in :
Identification of a new transcription factor in case of mechanical stimulation in Arabidopsis & Poplar sp. (Equipe MECA, UMR PIAF Clermont-Ferrand)
PtaZFP2

12. Mechanosensor in plant genetic equivalent in animal
Introduction
Expression précoce
Il existe un equivalent genetique chez l’animal….
Martin, 2009
Mechanosensor in plant genetic equivalent in animal
PtaZFP2
EGR-4 12

13. Introduction EGR Family: 4 subtypes (EGR-1)
Transcription factor/ Early Gene Response
Zinc fingers structure/ Same DNA binding sequence : GCC G/TGG GCG
Largely expressed in periphery and central nervous system
Description in cognitive process

14. Introduction EGR-4 Only two major studies
 Surexpression in somatosensory cortex after mechanical stimulation.
 Implication in pro-inflammatory cytokines production in T-cells.
PCR EGR-4
(Mack et al., 1995).

15. Aim of the Study
Involvement of EGR-4 transcription factor in visceral mechanosensation?

16. syringe and rectal probe
Material and methods
C57Bl6J Mice, 6-8 weeks old.
Colorectal distension with100 µL (water) during10 seconds.
Viscero-motor response
syringe and rectal probe
20µl
40µl
60µl
80µl
100µl 16

17. Materials and methods
samples at different time point after distension.
Colon 17

18. Materials and methods
samples at different time point after distension.
Colon
DRG visceral (T10-13, L6 & S1) 18

19. Materials and methods
samples at different time point after distension.
Colon
DRG visceral (T10-13, L6 & S1)
Spinal cord 19

20. Expression of EGR-4 Euthanasia distension 1h30 2h 45 min 30 min 15 min
45 min
30 min
15 min
10 min
5 min 1h

21. ? Expression in colon, DRG
Expression of EGR-4
Euthanasia
distension
5 min
10 min
15 min
30 min
45 min 1h
1h30 2h
 Western Blot
? Expression in colon, DRG
and spinal cord

22. Expression of EGR-4 in colon
Increase of total form of EGR-4 30 minutes after distension

23. Expression of EGR-4 in DRG T11-13, L6 & S1
Increase of total form of EGR-4 45 minutes after distension

24. Expression of EGR-4 in spinal cord
Increase of total form of EGR-4 45 minutes after distension

25. EGR-4 Colon, DRG & spinal cord
Conclusion
Development new tools (PCR, WB, HIC)
distension
15 min
30 min
45 min
Short Time :
EGR-4 Colon, DRG & spinal cord

26. Perspectives Future studies Long time expression (WB)
mRNA expression studies (qPCR)
Identification of target genes (micro-array)
Female
Different models of colonic Hypersensitivity
post-infectious
neo natal stress

27. Thank you for your attention
Acknowledgement
Monique Etienne
Ludivine Boudieu
Emilie Muller
Agathe Gelot
Frederic Carvalho
Denis Ardid
Thank you for your attention

28. Protein expression : IHC
Colon
Fluorecsence intensity / surface unit
distension
1h30
3h30
Euthanasia
DRG noyau
Proprtion of immuno marqued nucleus neuron
Spinal cord
Fluorecsence intensity / surface unit

29. Localization of EGR-4 : IHC
Colocalisation with sensitive fibers in DRG.
Paraffine
Anti-NGFI-C 1:500
Colocalisation with nervous fibers in colon