1. © 2001 by KJS
5장 고성능 액체크로마토그래피(1)

2. LC vs. GC Two chromaographic phase for LC vs. one in GC - selectivity
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LC vs. GC
Two chromaographic phase for LC vs. one in GC - selectivity
A great variety of column packing
Lower separation temperature in LC

3. Liquid Chromatography 분리 원리
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Liquid Chromatography 분리 원리
분배 partition (LLC)
흡착 adsorption (LSC)
이온교환 ion exchange
크기 배제 size exclusion

4. © 2001 by KJS
HPLC Flow Diagram

5. 펌프의 종류 왕복식: 피스톤의 왕복운동 구슬제어밸브 용매흐름에 펄스 발생 치환형: 피스톤이 붙어 있는 원통 펄스의 발생이 없음
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펌프의 종류
왕복식: 피스톤의 왕복운동
구슬제어밸브
용매흐름에 펄스 발생
치환형: 피스톤이 붙어 있는 원통
펄스의 발생이 없음
용매용량 제한
가압식: 용기속의 용매를 압축기체에 의해 이송
단가 저렴
기울기 용리 불가
저압에서만 사용

6. pump mechanism (a) (b) [그림5-3] 왕복피스톤 펌프(a, b)와 역류방지밸브 (c) (c) Cam
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pump mechanism
Plunger
(a)
Solvent in
Solvent out
Plunger seal
Plunger (sapphire)
Outlet check valve
Inlet check valve
(b)
Cam
[그림5-3] 왕복피스톤 펌프(a, b)와 역류방지밸브 (c)
(c)

7. Pump output patterns (a)single-head reciprocating
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Pump output patterns
(c) dual-head sinusoidal cam
(a)single-head reciprocating
(b)dual-head circular cam

8. Pump 작동시 주의사항 사용 용매의 탈기 용매가 없는 상태에서 Pump on 하지 말 것
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Pump 작동시 주의사항
사용 용매의 탈기
용매가 없는 상태에서 Pump on 하지 말 것
Buffer 사용 후 물로 충분히 세척
다른 용매를 사용하는 경우 섞임성 확인
Pump priming 실시
Pulse 없는 상태로 계속적인 용매 흐름 조절
Pump 압력 확인 (높은지, 낮은지, 일정한지 확인)
용매 내에 용해되어 있는 가스성분(주로 산소)은 이동상 및 고정상과 반응을 일으킬 수도 있고 펌프에 무리가 갈수도 있기 때문에 사용 전에 탈기 과정을 실시하여야 한다.
Buffer사용 후 세척하지 않으면 펌프에서 염이 석출되어 Pump head의 outlet부분이 막히게 되거나 수명을 단축시킨다. 세척 시 가장 좋은 방법은 낮은 유속으로 장시간 씻어주는 것이며, 일반적으로 세척양은 컬럼 dead volume의 20배 정도가 적당하다.
용매를 바꿀 경우 용매들간 섞이는 정도를 고려하여야 한다.
BENE TECHNOLOGY 8

9. Low and high pressure gradient mixing
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Low and high pressure gradient mixing A B

10. Six-port high-pressure injection valve
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Six-port high-pressure injection valve

11. Injector 작동시 유의사항 잘 세척된 Syringe 사용 시료 주입시 기포는 완전히 제거
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Injector 작동시 유의사항
잘 세척된 Syringe 사용
시료 주입시 기포는 완전히 제거
Syringe 세척은 시료가 잘 녹는 용매를 사용
강한 세척 요구 시, 사용용매  Acetone  Dichloromethane 순으로 세척
Auto injector needle wash 용 용매 사용 시 주의
시료확산을 방지하기 위해 injector와 column, column과 detector사이 연결을 짧게 연결(0.009inch)
잘못된 Tubing 연결 시 dead volume 생김.
- 주사기에 기포가 있을 경우 실험결과의 재현성을 얻기 힘들므로 기포는 완전히 제거하여야 한다.
- Needle wash용 용매는 시료와 이동상의 화학적인 성질을 고려하여 선택하여야 하며 일반적인 선택방법은 다음과 같다.
이동상 Needle Wash
Buffer aqueous, Reverse phase 50% H2O 50% MeOH
Non aqueous, Reverse phase % MeOH
Normal phase Mobile phase
GPC Mobile phase
Ion exchange H2O 11

12. Auto Injector Free injection하여 생산성을 향상 조건입력 가능 무인 가동할 수 있으므로 분석 시간 단축
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Auto Injector
Free injection하여 생산성을 향상
조건입력 가능
무인 가동할 수 있으므로 분석 시간 단축
온도 조절을 통해 시료의 변성 가능성을 최소화
시료의 주입량의 오차가 거의 없으므로 재현성 우수
Auto priming 및 Auto needle washing이 가능함
Heater나 Cooler를 장착하여 시료가 들어있는 Vial 부분을 4~40C 범위로 조절이 가능하다.
Needle wash pump의 auto-priming이 가능
Auto-needle washing 기능은 시료의 연속 주입시 발생할 수 있는 주사기의 오염을 방지한다.
Auto Standards 기능 : 먼저 standards를 주입 >> 시료들을 주입 >> 다시 같은 standards를 주입
Auto Addition 기능 : common vial과 sample vial에 들어 있는 용액의 일정량을 각각 취하여 혼합한 뒤, 그 총량을 컬럼에 주입하는 기능이다. 이 기능은 유도체시약이나 표준물 등의 자동적인 첨가등에 유용하게 사용될 수 있다. 12

13. The most important parameters for analysis
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The most important parameters for analysis
LOD : limit of detection (S/N = 2-3)
LOQ : limit of quantification (S/N = 10-20)
Linearity : calibration
Selectivity
Qualitative information

14. Types of detectors UV, diode array detector refractive index detector
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Types of detectors
UV, diode array detector
refractive index detector
fluorometric detector
electrochemical detector
evaporative light-scattering detector
radioactivity (radioisotope) detector
ORD/CD
LC-MSD

15. [표5-1] HPLC 검출기의 분류 Selective Detector Specific
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[표5-1] HPLC 검출기의 분류
Selective Detector
Specific
Less influenced by changing solvent
Sensitive UV
Fluorescence
ECD
Mass
Universal Detector
Universal
Wider range of application RI
ELSD

16. © 2001 by KJS
Z-type cell
Tapered cell
[그림5-12] UV/Vis detector

17. © 2001 by KJS
Tapered Cell을 사용하는 고감도 검출기
일반 검출기 셀의 경우 셀 내에 들어온 빛은 굴절을 일으켜 들어온 빛이 모두 검출기로 들어가지 못해 셀 내에 시료가 없더라도 마치 빛을 흡수하는 물질이 있는 것처럼 보이지만 Tapered Cell은 셀 내에 들어온 빛이 모두 검출기로 들어가므로 고감도의 분석을 가능하게 합니다.
Tapered Cell
검출기 셀의 구조

18. Characteristics of UV detector
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Characteristics of UV detector

19. © 2001 by KJS

20. © 2001 by KJS
Excitation Spectrum
Emission Spectrum

21. Selectivity of fluorometric detector
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Selectivity of fluorometric detector

22. © 2001 by KJS
[그림5-16] 2종류 검출기의 동시 사용

23. Evaporative Light-Scattering Detection (ELSD)
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Evaporative Light-Scattering Detection (ELSD)

24. Volatile Mobile Phase Modifiers
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Volatile Mobile Phase Modifiers
pKa
pKb
pH Range BP MP
Acids
Trifluoroacetic Acid
0.3
13.7
72.4°C
Formic Acid
3.75
10.25
100.7°C
Acetic Acid
4.75
9.25
116.0°C
Carbonic Acid
6.37
7.63 —
Bases
Ammonia
33.35°C
Methylamine
10.81
3.19
16.6°C
Ethylamine
10.66
3.34
-6.3°C
Triethylamine
11.01
2.99
89.3°C
Buffers
Ammonium Formate
120°C
Pyridinium Formate
Ammonium Acetate
111°C
Pyridinium Acetate
Ammonium Carbonate (for reverse phase)
8.0 (adjusted)
Ammonium Carbonate
and

25. Measurements of mass concentration
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Measurements of mass concentration

26. Characteristics of RI detectors
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Characteristics of RI detectors

27. © 2001 by KJS

28. © 2001 by KJS

29. [그림5-20] ELSD와 RI의 비교 © 2001 by KJS RI ELSD Carbohydrates 1. Fructose
2. Glucose
3. Sucrose
Column: Prevail™ Carbohydrate ES, 5µm,
53 x 7mm
Mobile Phase: Acetonitrile:Water (75:25)
Flowrate: 2.0mL/min
[그림5-20] ELSD와 RI의 비교

30. Electrochemical reactions
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Electrochemical reactions

31. Electrochemically active functional groups
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Electrochemically active functional groups

32. Design of electrochemical flow cell
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Design of electrochemical flow cell

33. © 2001 by KJS
223
182
185
Time (ms)
-1.0
-0.4
+0.8 E1 E2 E3 S
E(V)
Pulsed amperometric detection of carbohydrate with Pt-electrode
E3 : Reducing potential
Surface PtO is reduced to Pt. Regeneration of electrode-surface
E1: Measuring potential
Oxidation of carbohydrate on the surface of the electrode
E2 : Oxidation potential
Surface oxidation to PtO and desorbs oxidation product of carbohydrate
[그림5-24]

34. Compound types sensed by the ECD
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Compound types sensed by the ECD

35. © 2001 by KJS

36. © 2001 by KJS

37. © 2001 by KJS

38. Magnetic sector mass filter
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Magnetic sector mass filter

39. © 2001 by KJS

40. © 2001 by KJS
Ion Trap mass filter

41. Time of Flight (TOF) mass filter
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Time of Flight (TOF) mass filter

42. © 2001 by KJS
API (atmospheric pressure ionization) LC/MS interface Electrospray ionization (ESI) Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
Collision Induced Decomposition

43. API-Electrospray ion source
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API-Electrospray ion source

44. © 2001 by KJS

45. © 2001 by KJS
APCI interface

46. ESI vs. APCI evaporation and explosion suitable for polar samples
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evaporation and explosion
suitable for polar samples
flow rate (1) ml/min
wide range of molecular weight
drug and metabolites
peptides
proteins
natural products
ion molecular reaction
suitable for less polar samples
flow rate - 1 (2) ml/min
stable operation
pesticides
steroids
drugs

48. Radioactivity detectors
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Radioactivity detectors
Monitoring radio-labeled solutes
homogeneous system: column eluent is mixed with a liquid scintillation cocktail before passing through a flow cell.
heterogeneous system: the eluent moves directly to the flow cell, packed with solid scintillant.

49. CD 검출기 vs. ORD 검출기 Flavone (0.1ug)의 크로마토그램 CD검출기: D-L 체가 검출
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CD 검출기 vs. ORD 검출기
Flavone (0.1ug)의 크로마토그램
CD검출기: D-L 체가 검출
OR검출기: 감도가 낮아 검출 불가
CD 검출기가 OR 검출기에 비해 월등한 S/N를 보이므로 UV를 흡수하는 물질인 경우엔 CD검출기를 사용하는 것이 좋다. 하지만 UV를 흡수하지 않는 물질인 경우엔 ORD 검출기를 사용해야 한다.
Column : CHIRALCEL OD
94.6mmIDx250mmL
Eluent : n-Hexane/PA(90/10)
Flow rate : 1.0ml/min
Temperature : 20C
Injection Volume : 10l