2. BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA JAUNĀ BIOTEHNOLOĢIJA I. Muižnieks, 2013. g.

3. SVEŠA PROTEĪNA EKSPRESIJA BAKTĒRIJĀS 1. EKSPRESIJAS REGULĀCIJAS LĪMEŅI 2. TRANSKRIPCIJAS REGULĀCIJA a.promoters b.operators c.aktivatori d.terminatori 3. DNS SEKVENĒŠANAS PRINCIPI 4. DNS UN PROTEĪNU MIJIEDARBĪBAS PĒTĪŠANA

4. GĒNU INŽENIERIJA RESTRIKTĀZES, LIGĀZES, DNS MODIFICĒJOŠIE ENZĪMI

5. GĒNA EKSPRESIJAS REGULĀCIJAS LĪMEŅI: 1.Transkripcija 2.mRNS stabilitāte 3.Translācija 4.Proteīna funkcionalitāte un stabilitāte 5.Replikona funkcionalitāte un stabilitāte 6.Šūnas kopējie regulācijas tīkli un metabolisma homeostāze

6. GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA, KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU KODĒJOŠĀ DAĻA P - promoters, nukleīnskābes rajons, kurā sākas gēna informācijas pārrakstīšana par mRNS O - operators, nukleīnskābes rajons, kas regulē promotera aktivitāti T - terminators, nukleīnskābes rajons, kurā tiek pārtraukta gēna transkripcija POT GĒNA DARBĪBU REGULĒ:

7. Transkripcija un translācija: prokarioti/ eikarioti

8. Transkripcijas cikls

9. Transkripcijas regulācija Polimerāzes saistīšanas etapi

10. Promotera un RNS polimerāzes saisitības efektivitātes noteikšana Hinc restrikcijas saita aizsardzība ar RNAPol proteīnu

11. Promotera spēks – RNS sintēzes efektivitātes mērīšana

12. Transkripcijas regulācija

13. Operons GĒNU EKSPRESIJAS REGULĀCIJA Cistrons Operators RNA-Pol piesaiste +1 SD DB

14. Promoters Promotera sekvences pamatelementi

15. Transkripcijas regulācija

16. Plazmīda ar klonētu promotera rajonu DNS fragments, kas satur promotera rajonu mRNS starta punkta kartēšana ar S1 nukleāzi METODES

17. Walter Gilbert, 1932 Andrejs Mirzabekovs, 1937 -2002 DNS sekvenēšana ar daļēji specifiskas ķīmiskās degradācijas palīdzību

19. http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_ id/20

20. dimethoxytrityl 3'-O-(N,N-diisopropyl phosphoramidite) benzoyl isobutyr yl

23. Frederick Sanger, 1918

25. www.nwfsc.noaa.gov/.../figur es/moranfig4.htm

26. METODES Manuāla sekvenēšana

27. Analīzes metodes

29. Resekvenēšanas metodes “Resekvenēšana”, vai genoma sekvenēšana n to reizi, vai genoma daļas sekvenēšana organismam, kam viena genoma sekvence jau zināma (vai pat radniecīgam organismam) ir vieglāka un lētāka nekā de novo sekvenēšana. Vairākas firmas piedāvā liela apjoma, ātrdarbīgas paralēlās resekvenēšanas platformas. 454 Life Sciences (http://www.454.com/enabling-technology/the-system.asp) Solexa (Illumina) (http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=203)

30. Samuel Levy, et al. (Craig Venter) The Diploid Genome Sequence of an Individual Human PLoS BIOLOGY October 2007 | Volume 5 | Issue 2113 10 | e254 David A. Wheeler, et al. (James Watson) The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing Nature 452, 872-876 (17 April 2008) Jeffrey M. Kidd, et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes Nature 453, 56-64 (1 May 2008) PERSONISKIE GENOMA PROJEKTI

32. Analīzes metodes

35. Solex – Illumina tehnoloģija

36. Analīzes metodes Solex – Illumina tehnoloģija

37. Analīzes metodes Solex – Illumina tehnoloģija

38. Solex – Illumina

40. JONU PUSVADĪTĀJU SEKVENĒŠANA –ION TORRENT TECHNOLOGIES

41. The Ion Proton™ Sequencer is ideal for sequencing both exomes — regions in the DNA that code for protein — and human genomes. The Ion Proton™ I Chip, ideal for sequencing exomes, will be available mid-2012. The Ion Proton™ II Chip, ideal for sequencing whole human genomes, will be available about six months later. In addition, the Ion Proton™ OneTouch™ system automates template prep and a stand-alone Ion Proton™ Torrent Server performs the primary and secondary data analysis. January 10, 2012 Life Technologies Benchtop Ion Proton Sequencer will sequence human genomes in one day for less than $1000 by yearend and Illumina will have a competing sub-$1000 per human genome sequencer by yearend

42. Nanopore DNA sequencing technique promises entire genome in minutes or your money back

43. Samuel Levy, et al. (Craig Venter) The Diploid Genome Sequence of an Individual Human PLoS BIOLOGY October 2007 | Volume 5 | Issue 2113 10 | e254 David A. Wheeler, et al. (James Watson) The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing Nature 452, 872-876 (17 April 2008) Jeffrey M. Kidd, et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes Nature 453, 56-64 (1 May 2008) October 31, 2012 An integrated map of genetic variation from 1092 human genomes An Integrated map of genetic variation from 1092 human genomes is now available from Nature and can be downloaded directly from the ftp site. PERSONISKIE GENOMA PROJEKTI

44. Advances in DNA sequencing technology have sharply reduced the amount of time and money required to identify all three billion base pairs of DNA in a person’s genome. But the use of genomic information for medical decisions is still limited because the process creates such large volumes of data. Less than five years ago, Knome, based in Cambridge, Massachusetts, made headlines by offering what seemed then like a low price— $350,000—for a genome sequencing and profiling package. The same service now costs just a few thousand dollars. Knome Software Makes Sense of the Genome The startup’s software takes raw genome data and creates a usable report for doctors. June 12, 2012

45. Transkripcijas regulācija Operators Negatīvā kontrole ar iespējamu indukciju Represors / induktors lacZ –  galaktozidāze lacY – laktozes permeāze lacA – laktozes transacetilāze laktoze 1, 4-O-  -D-galaktopiranozil-  -D-glikopiranozīds

46. Izopropil-β-D-tio-galaktozīds (IPTG) lac operona induktors 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-D-galaktozīds (X-gal) lac operona hromogēnais substrāts Ortofenil-β-D-galaktozīds lac operona hromogēnais substrāts

47. Operators Negatīvā kontrole ar iespējamu represiju Aporepresors / korepresors Triptofāns Indolilakrilskābe

48. Operators Pozitīvā kontrole ar represiju Aktivators / inhibītors

49. Operators Pozitīvā kontrole ar indukciju Apoaktivators / Koaktivators

50. Transkripcijas regulācija: UP (proteīna neatkarīgie) - elementi

51. Transkripcijas regulācija: CAP aktivācija CAP- proteīna saistīšanās konsensus: TGTGA --- N6 --- TCACA

52. Transkripcijas regulācija: enhanseri (pastiprinātāji)

53. Transkripcijas regulācija: atenuācija, trp-operons

54. H-t-H motīvs operatoru – regulācijas proteīnu mijiedarbībā

55. DNS cilpu veidošana operatoru – regulācijas proteīnu mijiedarbībā

56. rafA gēna promotera sekvence

57. Ar proteīnu sastīta DNS fragmenta migrācijas aizkavēšana elektroforēzē, EMSA

59. DNS aizsardzība pret (DNāzes) degradāciju: “footprinting”

60. rafA promotera fragmenta fūtprints ar norādītajiem proteīniem. Vai var atrast represora un CAP proteīna saistīšanās vietas, noteikt to sekvences ?

63. lac, tac vai trc (-35 trpE, -10 lac) ar IPTG indukciju vai termolabila LacI klātbūtnē, stiprākai regulēšanai - vairāk LacI; T7 vēlīnā promotera sistēma, pārliecīga aktivitāte, toksiskums, proteīnu agregācija; cold-shock-proteinu gēnu CspA promoteri. 10 o C, lai izvairītos no agregācijas; P L arī aukstuma inducējams; phoA, trpE promoteri - inducējami ar barības vielām vai to trūkumu. Transkripcijas regulācija: biotehnoloģijā izmantojamās promotera-operatora sistēmas

64. mRNS 5’ netranslētajā galā esošās secības, kas nepieciešamas ribosomu saistīšanai SD sequence consensus: GGAGG located 7 ± 2 nucleotides upstream from the initiation codon undergo base-pairing to the 3' of the 16S rRNA of the 30S ribosomal subunit. Ribosomal protein S1 interacts with a pyrimidine-rich region 5' to the SD region on mRNAs. A region named the downstream box (DB), downstream from the initiation codon of several mRNAs was found to show complementarity to bases 1469 to 1483 within the 16S rRNA. Merylin Kozak, eikariotu mRNS

65. Transkripcijas regulācija Terminācija:  atkarīgā  - neatkarīgā

66. Transkripcijas regulācija  – neatkarīgā transkripcijas terminācija

67. Transkripcijas regulācija  – neatkarīgās transkripcijas terminācijas sekvences