1. Digital Imaging

2. Digital image - definition Image = “a two-dimensional function, f(x,y), where x and y are spatial coordinates, and the amplitude of f at any pair of coordinates (x, y) is called the intensity (gray level of the image) at that point. When x, y, and the amplitude values of f are all finite, discrete quantities, we call the image a digital image.” (Gonzalez and Woods).

3. Analog to digital conversion הדמות המתקבלת לאחר האופטיקה היא אנלוגית, כלומר התפלגות רציפה של הסיגנל במרחב. לשם נוחות אנו מעוניינים להפוך את הדמות לדיגיטלית, כלומר בדידה.

4. Analog to digital conversion הדמות המתקבלת לאחר האופטיקה היא אנלוגית, כלומר התפלגות רציפה של הסיגנל במרחב. לשם נוחות אנו מעוניינים להפוך את הדמות לדיגיטלית, כלומר בדידה.

5. Analog to digital conversion התמונה הדיגיטלית מורכבת ממערך של פיקסלים המייצגים ערכי עוצמה ומסודרים בקורדינטות מרחביות. ההמרה מאנלוגי לדיגיטלי מתבצעת בשני שלבים : Sampling – התהליך בו הופכים לדיגיטלי את המידע המרחבי. Quantization – התהליך בו המידע על ערכי המשרעת באותם קורדינטות מרחביות הופך לדיגיטלי

6. Image map

7. 512 255 0 Image map

8. Image resolution Image resolution is a measure of the degree to which the digital image represents the fine details of the analog image recorded by the microscope. האיכות ( רזולוציה ) של התמונה הדיגיטלית נקבעת ע " י שני גורמים : Spatial resolution - המספר הכולל של הפיקסלים בתמונה. Grayscale/Brightness range/Bit-depth - טווח ערכי הבהירות האפשרי לכל פיקסל.

9. Spatial resolution ככל שמספר הפיקסלים ליחידת שטח גדל, גדלה הרזולוציה המרחבית. המצב האופטימאלי הוא כאשר מתאימים את תדירות הדגימה (sampling frequency) לרזולוציה של הדמות המתקבלת מהמיקרוסקופ.

10. Spatial resolution The Nyquist criterion המרחק בין כל דגימה (sampling interval) צריך להיות לכל היותר חצי מהרזולוציה האופטית. ע " מ לקבל תמונות באיכות גבוהה, רצוי שיהיו 2.5-3 דגימות לרזולוציה האופטית. דוגמה : אם הרזולוציה של המיקרוסקופ היא 0.22 מיקרון ואני סורק 512 פיקסלים, שדה הראיה המקסימלי יהיה כ - 56 מיקרון (512x0.11). שדה הראיה האופטימלי יהיה כ -37 מיקרון (512x0.22/3).

11. 128 x 128 256 x 256 512 x 512 64 x 64 Spatial resolution Changing the resolution of the image without changing bit-depth

12. Brightness - Bit depth בתהליך הקוונטיזציה אנו ממירים את עוצמת הגוון הרציף של הדוגמה לערכי בהירות דיגיטליים. הדיוק של הערכים הדיגיטליים פרופורציוני ל -bit depth.

13. 2 2 =4 2 1 =2 0,1 Black and White Image 2 0 =1 2 8 =256 0,1,2, …. 255 256 Grey Levels Image 2 14 =16384 2 10 =1024 2 16 =65536 Gray level - Bit depth Gray level resolution is a term used to describe the binning of the signal rather than the actual difference we managed to obtain when we quantized the signal. 8-bit and 16-bit images are the most common ones, but 10- and 12-bit images can also be found. בכל המקרים 0 מייצג לבן והערך הכי גבוה מייצג שחור. כל הערכים שבתווך מייצגים רמות שונות של אפור.

14. Black and White (1 bit per pixel(16 Greys (4 bits per pixel) 256 Greys (8 bits per pixel) Bit depth

15. False contouring due to insufficient grey levels Eye has limited ability to distinguish grey levels/colours Above 32 grey levels images look smooth - 16 and below grey levels eye perceives objectionable banding = false contours. Low level Processing - Grey level display http://www.lenswork.com/calibrate.htm#tones_t

16. 2bit 3bit 4bit 8bit 1bit Changing the bit-depth of the image without changing spatial resolution Bit depth

17. a measure of changes in image signal intensity (ΔI) in relation to the average image intensity (I): C = ΔI/ I the Rayleigh Criterion is not a fixed limit but rather, the spatial frequency at which the contrast has dropped to about 25 percent. Contrast

18. Signal to noise - definitions S:N ratio = One of the most important limitations to image quality and image processing Signal Variation in the signal Noise is NOT: background, auto-fluorescence or dark signal Good image data has a high S:N ratio

19. Signal to noise – shot noise Additional sources of noise: digitisation, detector readout, thermal noise. Average signal = 9, S:N ratio = 3 Average signal = 100, S:N ratio = 10 Average signal = 10,000, S:N ratio = 100 Statistics of photon counting dictate the minimum useful signal A meaningful difference in intensity needs to be at least three times the noise level Poisson distributed variation: S:N ratio = n √n Fundamental limit = Poisson distributed statistics of photon detection also known as Shot Noise shot noise is associated with the particle nature of light.

20. Signal to noise – shot noise Going from left to right, the mean number of photons per pixel over the whole image is (top row) 0.001, 0.01, 0.1 (middle row) 1.0, 10.0, 100.0 (bottom row) 1,000.0, 10,000.0 and 100,000.0. A photon noise simulation, using a sample image as a source and a per-pixel Poisson process to model an otherwise perfect camera (quantum efficiency = 1, no read-noise, no thermal noise, etc).

21. 1000 photons / pixel100 photons / pixel10 photons / pixel Signal to noise – shot noise

22. Time and noise - tradeoffs The number of photons collected by the camera generally determines the amount of noise in your image Noise = square root (# of photons) Doubling signal to noise ratio requires 4-fold increase in exposure

23. Noise and resolution Two spots separated by diffraction limit Theoretical perfect data

24. Noise and resolution 1000 ph/pixel at peak With shot noise 100 ph/pixel at peak10 ph/pixel at peak

25. Noise and resolution 1000 ph/pixel at peak Expected error bars with shot noise 100 ph/pixel at peak10 ph/pixel at peak

26. Noise and resolution High resolution and precise quantitation both require lots of light This means bright samples or long exposures This may cause problems with photobleaching and phototoxicity Be aware of potential tradeoffs between precision, speed, and photobleaching

27. The definitions of noise components in image data are confusing. Noise = variation in signal - you cannot simply subtract a “noise value”. Noise is NOT dark signal or background but they CONTRIBUTE to image noise. Dark signal = generated by camera Has an average value component and a noise (variation) component. Subtracting a dark offset value does not remove the noise component. Background = autofluorescence of sample Is a real fluorescence signal and has associated shot noise. Subtracting an autofluorescence image does not remove the noise. Signal to noise - take home messages

28. Presentation of 16-bit Image in OS Windows