1. Virus 검사에 PCR의 응용
발표 : R2 김영철

2. PCR을 이용한 virus 검사항목 HPV (16,18) Polioma Virus (BK,JC) - RFLP CMV
Parvovirus
HSV type 1,2
HHV type 6
Rhinovirus
Enterovirus
Coronavirus
Mumpes virus
HCV

3. Virus 검사에서 검체의 채취 호흡기 검체- nasopharyngeal aspirate 대변- 발병 후 4일 이내에 채취
혈액- sodium citrate tube
뇌척수액- 혈액이 섞이지 않게
면봉검체- 수포성:26G 주사기
소변- 중간뇨 10 mL
기타검체- 마르기쉬운 검체: 운송배지

4. DNA 분리방법 Lysis: 0.5% SDS, Proteinase K
Purification of nucleic acid : Extraction with Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol
Concentrating Nucleic acid: Ethanol precipitation, sodium acetate
DNA washing
DNA solubulization

5. RNA 분리방법 Lysis:Tri-reagent Phase separation: chloroforum
RNA precipitation: isopropyl alcohol, Glycogen
RNA washing
RNA solubulization

6. Coprecipitants
During centrifugation, carriers generate a visible pellet that facilitates handling of the target nucleic acid
Glycogen, Linear polyacryamide, Yeast tRNA

7. Determination of DNA conc.
Beer-Lambert Law
dsDNA 50 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
sDNA 33 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
sRNA 40 ug/mL의 흡광도는 260 nm에서 1.00
Concentration of DNA (ug/mL)
= (A260-A320) X 50 ug/mL X dilution
Measure of purity of isolated nucleic acid :
ratio of the absorbance at 260 nm and 280 nm

8. PCR 의 원리
Denaturation
Annealing
Extension

9. PCR reaction mixture Component Vol./reaction Final conc./reaction
Template DNA
Variable
< 1 ug/reaction
dNTP mix (10 mM each)
2 uL
200 uM of each dNTP
Primer A
0.1 –0.5 uM
Primer B
Taq polymerase
0.5 uL
2.5 U
PCR buffer
10 uL
D.W
Total volume
100 uL

10. The amount of PCR product
Product = 2n x l x m A
(n: number of heat cycle, l: lengnth of amplified fragments in base pairs,
m: average mass of a base pair(constant),
A: Avogadro, number, 6 x 1023)

11. Detection
Sensitivity of detection with ethidium bromide – 10 ng of DNA가 검출될 수 있다.
기타 염색에서의 검출율
Polyester-backed polyacrylamide gel에서는 silver stainning을 하면 picogram까지 검출할 수 있다.

12. Quantitation of nucleic acids
Absorbance at 260 nm by spectrophotometer
Emission at 458 nm in the presence of Hoechst by fluorometer
Dipstick (a kit from Invitrogen)
Ethidium bromide spot test by
UV transilluminator

13. Staining nucleic acids
Ethidium bromide - staining DNA in gels(~10 ng/band)
Methyene blue
Silver staining
- < 1.0 ng of DNA
analyze single-stranded DNA by SSCP
SYBR dyes

14. Summary
Labor intensive하지만 bcr-abl gene rearrangement 검사와 같이 1년에 몇 case되지 않는 경우 기존 기구를 이용하여 setting할 수 있겠습니다.
Nucleic acid 분리방법의 standard method를 이해함으로써 상품화된 시약을 평가 할 수 있겠습니다.