1. Biological clock
An innate mechanism in living organisms that controls the periodicity or rhythm of various physiological functions or activities.
Circadian rhythm
Circadian: circa(around)+dies(day)
Ultradian rhythm
Infradian rhythm
다양한 생리적 기능이나 활성의 주기나 리듬을 조절하는 생명체의 내부 메커니즘이다. 24시간주기의 circadian rhythm, 이보다 짧은 uitradian rhythm, 그리고 월주기성, 년주기성의 장기적인 infradian rhythm들로 나누어진다.
생명체는 고유한 내부의 biological clock 을 가지고 있지만 이들은 특정 환경의 변화에 따라 주위 환경에 맞추어야하기 때문에 reset되거나 전환되는 메커니즘을 갖는다. 이러한 메커니즘은 항상성(homeostasis)에 중요한 역할을 한다.
Internal biological clock
+ change of environment
Reset / entrainment mechanism

2. Relationship clock-associated genes and the photoreceptors
CCA1
LHY
FKF1
ZTL
Environments
Temperature
Light
Period
wave
생체시계를 작동시키거나 이와 관련된 유전자와 환경 특히 온도와 광환경이 상호작용을 하게되는데 가장 대표적인 clock associated genes으로서 arabidopsis 의 CCA1 등이 알려져 있으며 이들은 특히 광에의한 식물의 photomorphogenesis와 관련있다. Photoreceptor 가 circadian clock의 기능의 modulating과 암기와 광기주기에 대한 endogenous circadian oscillator 의 전환에 중요한 역할을 하리라 추정되고 있으나 아직 clock-associated genes과 photoreceptors의 관계는 분명하게 밝혀져있지 않다.
Relationship clock-associated genes and the photoreceptors

3. ELF3 Encodes a Circadian Clock-Regulated Nuclear Protein That Functions in an Arabidopsis PHYB Signal Transduction Pathway
따라서 오늘 발표할 내용은 clock-associated genes인 ELF3 와 photoreceptors인 phyb의 관계에 대해서 알아보고자 한다.
발표할 내용은 plant cell에 실린 문헌으로 circadian clock을 조절하는 nuclear protein인 ELF3가 아라비돕시스의 phyb signal transduction pathway에서 작용한다는 내용이다.

4. elf3
wild(C)
elf3-1
elf3-1:cosmid B8
elf3-1:cosmid E11 SD LD
Defective in light perception or light-mediated signal transduction
Defective in circadian rhythm responses
먼저 실험에 사용된 elf3의 특징을 살펴보면 광의 수용이나 광이 매개된 signal transduction에 결함이 있으며, circadian rhythm에도 결함이 있다.
다음 그림은 이를 나타낸 것이다. A)는 단일조건에서 10일간 자란 유묘이며, B)는 이들의 하배축 길이를 나타낸 것이다. Wild type에 비해 elf3는 단일조건에서 하배축이 신장하는 것을 볼 수 있다. 이는 광에의한 신호전달에 결함을 나타낸다.
C)는 장일조건에서 25일간 자란 식물의 개화상태를 나타낸 것이며, D)는 개화기까지 형성된 vegative leaves를 나타낸 것으로 개화시기를 알 수 있이다. Wild type에서는 장일일때 단일보다 개화가 빠르나 elf3-1은 일장에 무관하게 대조구보다 빠른 개화를 나타냈다. 이런 결과는 circadian rhythm에 결함이 생겼음을 나타낸다.
이런반응은 elf3-1의 vector로 이용된 cosmid type에 영향을 받았다. 특이하게 cosmid B8 은 elf3-1을 insertion 시켰어도 wildtype으로 표현형이 회복되었다.

5. Two types of photoreceptor
Five red/far-red light-absorbing phytochromes
Phytochrome A[PHYA], PHYB, PHYC, PHYD, and PHYE
Two blue/UV-A light-absorbing cryptochromes
CRY1 and CRY2
본 문헌에서는 두가지 종류의 photoreceptor 중에 phytochrome A와 b를 이용하여 실험하였다.

6. ELF3 novel 695 amino acid protein
without any significant homology to proteins of known function
glutamine/threonine-rich sequence and nuclear localization signal in the C-terminal region
transcription factor
Elf3 protein은 새로밝혀진 프로테인으로 695개의 아미노에시드로 이루어졌으며 현재 기능이 알려져 있는 단백질과는 유의적인 homology는 없다. 특징은 c-term에 glutamine/threonin rih sequence와 nuclear localization signal을 가지고 있어 transcription factor의 기능을 수행하리라 예상된다.

7. ELF3 function may be conserved between dicots and monocots.
Fig 1-A. Sequence comparison of ELF3 and putative ELF3 homologs
Arabidopsis
Cardamine
tomato
rice
maize
다른 특이한 점은 elf3와 homology를 갖는 putative elf3-1이 같은 아라비돕시스는 물론 냉이나 토마토 라이스 매이즈에서 발견되며, 이들은 매우 높은 conserved domain 을 보이고 있어 elf3-1의 기능이 쌍자엽과 단자엽간에 보전되어 있다는 것을 알 수 있다.
ELF3 function may be conserved between dicots and monocots.

8. Fig 1-B. ELF3 is a novel nuclear protein.
그림 1-B는 ELF3 protein의 cellular localization을 나타낸 것이다. Wild type 과 elf-3dml line을 나타낸 것이다. total protein 에는 wild type 과 elf-3 line에서 elf-3 antibody 와 binding 한 흔적이 보이지 않는다. 그러나 nuclear protein에는 다소 약하지만 wild type에서 77KD의 ELF가 detect 되었다. 따라서 elf-3 protein은 nuclear에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
그러나 역시 elf-3 line에서는 나타나지 않았다. 따라서 βATPase antibody를 이용해본 결과 nuclear fraction이 극히 작은 수준의 cytoplasmic protein contamination을 가지고 있음을 나타냈다. 따라서 band가 나타나지 않는 이들 elf3 line은 elf-3 gene을 갖지 않는 것으로 예상되었다.
Fig 1-B. ELF3 is a novel nuclear protein.

9. Fig 2는 elf-3 protein 의 축적이 light과 circadian clock에 조절된다는 것을 나타내고 있다
Fig 2는 elf-3 protein 의 축적이 light과 circadian clock에 조절된다는 것을 나타내고 있다. A)는 광기와 암기를12시간씩 둔 경우로서 elf3-1의 축적이 암기에 진입될때 최대가 된다는 것을 알 수 있다. 따라서 elf3-1 protein 의 축적이 circadian mannerfh 이루어지느지를 평가하기 위해 48시간 명기를 둔 처리와 12시간을 명기에서 남은 36시간을 암기에 두었을때 elf3-1 protein의 축적을 비교하였다. 그 결과 48시간 명기에서 자란 경우 elf3-1 protein 의 축적이 최대가 되는 시간이 다소 지연되었지만 약 24시간의 주기를 따랐다. 이를 두번 반복실험한 결과에서도 동일한 결과를 얻었다. 그러나 12시간 명기에 36시간 암기를 처리한 경우 elf3-1 의 축적이 낮았으며 이들의 circadian rhythm 의 조절이 지속되는지 평가히기 어려웠다. 이러한 결과 ELF3 protein 의 축적은 면기에서 이루어지마 암기상태에서 elf3-1 protein 급격한 감소는 암상태에서 circadian clock 기능을 조절하는 역할이 덜함을 나타내고 있다.
Fig 2. Accumulation of the ELF3 protein is regulated by light and the circadian clock.

10. Fig 3-1. ELF3 and PHYB proteins interaction in the Yeast Tow-Hybrid System
Phytochrome에 의한 Photomorphogenesis 에서 elf3-1 가 작용하는지를 실험하기 위해 elf3-1와 phyb의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 시스템을 이용하여 측정하였다.
elf3-1 DNA fragment 를 bait 로 이용하고 phyb DNA fragment를 prey 로 이용하였다. 그림 A)는 full length ELF3에 gal4 DNA binding domain (GBD)가 붙은 모습이고 full length를 N-term, M-term, C-term으로 나누어 bait로 사용하였다. 그림 b는 이들의 7가지 조합을 나타낸 것이다. 그 결과 1과 2에서 Yeast colony 가 selection media 에서 자란것을 보여주고 있다. 선발배지에서 colony를 형성하는 것은 yeast cell 내에 elf3-1와 phyb 가 interaction을 하는 것을 나타내며, 이때 phyb와 interaction을 하기 위해 띨3의 ㅜ-term이 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. Β-galactosidase activity 에서도 같은 결과를 나타내고 있다.

11. Fig 3-2. ELF3 and PHYB proteins interaction in Vitro
다음은 in vitro 에서의 결과이다. Full length phyB는 glutathion-S-transferase(GST)와 fusion 시켜 나타내었고, elf3-1 protein 은 35S labeling 시켰다. 이들을 같은 gel 상에서 autoradiography 와 total protein의 coomassie blue staining을 하였다. 그 결과 띨3는 red 와 far-red light absorbing form의 phyb 모두와 bingding 하는 것을 보여주고 있다.
Fig 2와 3을 종합해 볼때 elf3-1은 light 상태에서 축적되고 phyb 역시 light dependent 하게 nuclear 로 inport 한다는 보고등을 통해서 in vivo 에서도 elf3-1와 phyb의 interaction이 phyB-mediated photomorphogenesis를 조절할 수 있으리라 추정할 수 있다.
PHYB-ELF3 interaction in vivo could regulate aspects of PHYB-mediated photomorphogenesis

12. 따라서 다음 실험에서는 phytochrom-mediated early photomorphogenesis 에서 elf3-1 의 기능을 알아보기 위해 photochrome mutant와 elf3-1의 single mutant와 double mutant를 이용하였다.
Dark , white, red, far-red 의 light conditions에서 자란 유묘의 하배축길이를 나타낸 것으로 black bar는 wild type을 white 는 elf3-1를 3번째의 gray와 5번째의 막대는 phya와 b를 나타낸 것이며, 4번째와 6번째는 double mutation 시킨 것을 나타낸다.
앞선 연구에서 phya 211은 far-red를 phyb-9는 red light에 반응하는 능력에 결합이 있는 mutant로 보고되어 있다.
elf3-1 single mutant는 red light에서는 Phyb9과 유사한 표현형을 나타내었다. Elf3-1 와 phyb9의 double mutant는 red light에서는 딜3-1과 phyb-9 sigle mutant 와 유사한 표현형을 나타내었으나 white light 에서의 Elf3-1과 phyb 9 double mutant의 평균 하배축이 Elf3-1과 phyb9 sigle mutant 보다 더 길었다. 이는 Elf3-1 mutation이 red 나 far-red 광 이외의 white와 같은 광에도 둔감한 반응을 나타낸 다는 것을 보여준다. 이는 blue light photoreceptors의 작용을 거치는 것으로 추정된다.
이와 유사한 반응으로 1996에 보고된 문헌에서 blue/ green light 조건에서 Elf3-1 mutant 가 wild type보다 민감도가 낮아 초장이 길어졌다는 보고가 있다. 이는 Elf3-1이 red /far red 이외의 보다 단파장의 blue/white light에 적어도 부분적으로 반응한다는 것을 나타내는 것이다.
이와는 반대로 Elf3-1과 phyb211의 double mutant는 red 와 far-red 모두에서 하배축이 신장되는 것을 알 수 있다. 이로서 phya와 Elf3-1 은 묘의 발달조절에 대해 각기 다른냐후미 transduction pathway를 경유할 것으로 추정되었다.
Fig 4-A. Hypocotyl length of seedlings grown under dark, white, red, and far-red light condition.

13. 다음은 장일과 단일에서 single 과 double mutant 들의 flowering time을 나타낸 것이다
다음은 장일과 단일에서 single 과 double mutant 들의 flowering time을 나타낸 것이다. Elf3-1은 장일과 단일에 무관하게 개화시기가 단축되었으며, 앞선 연구에서 phya는 wild type보다 개화시기가 늦고 phyb는 개화시기가 짧아지며, 이두 type 모두는 photoperiod에 sensitive 하다고 보고되 있다.
Elf3-1과 phya211의 double mutation에서는 Elf3-1에 의한 개화촉진이 반정도 억제되어 나타나나 phyb9과의 double mutation에서는 완전히 Elf3-1에 의한 개화촉진이 나타나는 것을 볼 수 있다. 이는 flowering refulation에 Elf3-1와 phyb가 서로 dependent 하다는 것을 나타내는 것이다.
Fig 4-B Flowering time for wild type and mutant plants under LD or SD growth conditions.

14. 표 1은 phyb와 phytochrome signal transduction에서 Elf3-1의 funtion을 평가하기 위해 Elf3-1를 overexpression 시킨 type을 비교하였다. Red light 에서 재배했을 때 Elf3-1OX는 하배축이 매우 짧아졌고 red light에 매우 sensitive 했다. Phyb9과 Elf3-1OX의 double mutant는 Elf3-1OX에 미치지 못하고 ㅔㅓㅛㅠ9보다는 다소 초장이 높아졌다. 이러한 결과는 Elf3-1가 주로 phyb의 activity를 통해 red light에 반응하는 hypocotyl elongation을 조절하는 것을 나타낸다.
Elf3-1OX에서 wild type 보다 장일 조건에서 개화가 지연되었고 단일조건에서는 개화시기가 비슷하였다. 사진 5-C에서 장일조건에서 Elf3-1는 개화지연이 phyb에서는 개화촉진으로 초기 개화가 유도되었으나 Elf3-1 과 Phyb 의 double mutant에서는 Elf3-1가 phyb에 epistatic (상위적)이라는 것을 나타내었다.
Hy2-200와 Elf3-1OX는 phyb-9와 Elf3-1OX와 유사한 결과를 보였다. 이러한 결과는 Elf3-1가 phytochrome funtion에 indefendent 하게 floral transition timing을 조절한다는 것을 나타낸다.

15. Fig 5. Genetic interactions of the ELF3 overexpression(ELF3-OX) line with the phyB mutation