1. GMO IV Sulev Kuuse GMO IV Sulev Kuuse

2. Masahito Tachibana, Paula Amato, Michelle Sparman, Nuria Marti Gutierrez, Rebecca Tippner-Hedges, Hong Ma, Eunju Kang, Alimujiang Fulati, Hyo-Sang Lee, Hathaitip Sritanaudomchai, Keith Masterson, Janine Larson, Deborah Eaton, Karen Sadler- Fredd, David Battaglia, David Lee, Diana Wu, Jeffrey Jensen, Phillip Patton, Sumita Gokhale, Richard L. Stouffer, Don Wolf, and Shoukhrat Mitalipov "Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer" Cell (2013) Reprogramming somatic cells into pluripotent embryonic stem cells (ESCs) by somatic cell nuclear transfer (SCNT) has been envisioned as an approach for generating patient-matched nuclear transfer (NT)-ESCs for studies of disease mechanisms and for developing specific therapies. When applied to premium quality human oocytes, NT-ESC lines were derived from as few as two oocytes. NT-ESCs displayed normal diploid karyotypes and inherited their nuclear genome exclusively from parental somatic cells. Gene expression and differentiation profiles in human NT-ESCs were similar to embryo-derived ESCs, suggesting efficient reprogramming of somatic cells to a pluripotent state.

3. !!!! Elektriimpulss Kofeiin – prot.fosfataasi inhibiitor, ei lase munarakul väljuda meioosist 10 nM trihhostatin A – histoonide deatsetülaasi inhibiitor, lükkab käima embrüogeneesi

4. Nature, vol. 478, 6th Oct. 2011, pp. 70 - 77

6. - 35 haploidset munarakku + somaatilise raku diplidne tuum – jäi ellu 35 triploidset munarakku. Kõik arenesid kuni moorulani (100%) - Blastotsüsti staadiumini arenes 63st ootsüüdist 13 embrüot (21%)

7. Cell TypesCharacteristics Totipotent cells can give rise to all other cell types totipotency remains through the first few cell divisions ex. the fertilised egg Pluripotent cells Can develop into all cell types (except those that form the amniotic sac and the placenta) The early embryo consists mainly of pluripotent stem cells Multipotent cells Can develop into any of a family of closely related cell types ex. blood multipotent cells can develop into various blood cells

8. TypeProsCons Somatic cell replication Embryonic Stem (ES) cell No immune rejection Theoretically patient-specific transplantations possible No case of success Many human egg cells needed Ethical issue: Can clone humans Fertilized egg ES cell Pluripotent Much research done Immune rejection reducible via stem cell bank Fertilized egg usage Immune rejection Oncogenic potential (can't use for clinical trial) Induced pluripotent stem (iPS) Cell No ethical issue Pluripotent Oncogenic potential Abnormal aging Adult stem cell Much research No immune rejection Safe (clinical trials) Not as potential as ES cell

9. Further research and future prospects Since the original discovery by Yamanaka, much further research has been done in this field, and many improvements have been made to the technology. Here we discuss the improvements made to Yamanaka's research as well as the future prospects of his findings. 1.The delivery mechanism of pluripotency factors has been improved. At first retroviral vectors, that integrate randomly in the genome and cause deregulation of genes that contribute to tumor formation, were used. However, now, non-integrating viruses, stabilised RNAs or proteins, or episomal plasmids (integration-free delivery mechanism) are used. 2.Transcription factors required for inducing pluripotency in different cell types have been identified (e.g. neural stem cells). 3.Small substitutive molecules were identified, that can substitute for the function of the transcription factors.

10. 4. Transdifferentiation experiments were carried out. They tried to change the cell fate without proceeding through a pluripotent state. They were able to systematically identify genes that carry out transdifferentiation using combinations of transcription factors that induce cell fate switches. They found trandifferentiation within germ layer and between germ layers. E.g.) exocrine cells to endocrine cells, fibroblast cells to myoblast cells, fibroblast cells to cardiomyocyte cells, fibroblast cells to neurons. 5. Cell replacement therapy with iPS cells is a possibility. Stem cells can replace diseased or lost cells in degenerative disorders and they are less prone to immune rejection. However, there is a danger that it may introduce mutations or other genomic abnormalities that render it unsuitable for cell therapy. So, there are still many challenges, but it is a very exciting and promising research area. Further work is required to guarantee safety for patients.

11. 6.Can medically use iPS cells from patients with genetic and other disorders to gain insights into the disease process. - Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), spinal muscular atrophy (SMA), α1- antitrypsin deficiency, familial hypercholesterolemia and glycogen storage disease type 1A. - For cardiovascular disease, Timothy syndrome, LEOPARD syndrome, type 1 and 2 long QT syndrome - Alzheimer’s, Spinocerebellar ataxia, Huntington’s etc. 7.iPS cells provide screening platforms for development and validation of therapeutic compounds. For example, kinetin was a novel compound found in iPS cells from familial dysautonomia and beta blockers & ion channel blockers for long QT syndrome were identified with iPS cells. Yamanaka's research has “opened a new door and the world’s scientists have set forth on a long journey of exploration, hoping to find our cells’ true potential.” [28] [28]

12. Blastotsüsti injektsioon Hiire embrüost eraldatud ES-rakud on võimelised peale nende taasviimist teise hiire blastotsüsti lülituma kimäärses looma kõikide kudede koosseisu (kaasa arvatud idutee rakud). ES-rakkudesse inkorporeerunud retroviirus oli tuvastatav kimäärse hiire järglastes – seega viivad ES-rakud blastotsüsti kaasa ka retroviiruse, mis hiljem on esindatud blastotsüstist arenenud kimäärse looma järglastes (Bradley et a., 1984; Robertson et al., 1986). ES-rakkudest on võimalik suunatud mutatsioonidega (homoloogiline rekombinatsioon) genereerida mingi geeni suhtes mutantseid rakukolooniaid

13. EK-rakud ehk Evansi-Kaufmanni rakud Sir Martin J. Evans ja Matt Kaufmann – ESC J.Embryol Exp Morphol, 1984, pp. 75-86

14. Geenide homoloogiline rekombinatsioon bakterites on teada pool sajandit - Joshua Lederberg sai selle avastuse eest Nobeli preemia 1958. aastal.

15. 1. Märgitud geen, wt-geen, peab teadma asendatava geeni järjestust 2. Disainitakse konstrukt, mis sisaldab meid huvitavat geeni, reportergeeni (AB res või GFP), flankeeruvad DNA järjestused, mis on identsed asendatava wt-geeni järjestustegaga, positiivset Markerit (AB res geen) ja negatiivset markerit (tümidiinkinaasi geen) 3. Konstrukt leiab asendatava geeni piirkonna homoloogia alusel (ca kromosoomide paardumine mitoosis ja meioosis) ja toimub rekombinatsioon. Kõrge rekombinatsioonisagedus pärmil, hiirel, aga mitte inimesel. 4. Homoloogilise rekombinatsiooni toimumine 5. Kui toimub mitte-homoloogiline rekombinatsioon, võib rekombinatsioon toimuda juhuslikku genoomi punktis ning negatiivne selektsioonimarker (tümidiinkinas) võib mõjutada konstrukti avaldumist. 6. Homoloogilise rekombinatsiooni korral elab konstrukt üle AB selektsiooni, kuid gantsüklovir tapab kõik rakud, mis sisaldavad tk-geeni – olulised on nii pos kui neg selketsioonimarker.

16. Neo – neomütsiin tk – thümidiinkinaas (fosforüleerib nukleosiid gantsükloviiri)

17. Hiire nokautmutantide konstrueerimine. Huvipakkuva geeni funktsioon rikutakse, normaalne geen asendatakse rikutuga (mutantsega) genoomi homoloogilisel rekombinatsioonil. DNA sisestamisel embrüonaalsetesse tüvirakkudesse ja embrüo implanteerimisel viljastatud emasesse põhjustatakse kimäärsete järglaste teke. Heterosügootsete kimääride omavahelisel ristamisel või kimäärse isase ristamisel metsiktüüpi emasega saadakse nokauteeritud geeniga homosügoote, mis on ka ravimiresistentse fenotüübiga. Ain Heinaru Ekson Vektorisse kloneeritud geen Blastotsüst Ravimiresistentsuse geen Eukarüootse geeni inaktiveerimine vektoris Homoloogiline rekombinatsioon Märklaudgeen hiire kromosoomis Nokauteeritud geen hiire muteerunud kromosoomis Transfektsioon Tüvirakkude kultuur Tüvirakkude kultuur rekombinantse DNA-ga Sisemine rakumass Transfekteeritud tüvirakkude süstimine blastotsüsti Süstitud blastotsüsti implanteerimine emasesse X Pseudoviljastatud emane Kimäärne emane (heterosügoot) Nokauteeritud geeniga (mutantne) hiir(homosügoot) Sünnitab Kimäärne isane (heterosügoot) Ravimiresistentsuse geeniga inaktiveeritud eukarüootne geen Poreerimine

18. Injektsiooni meetodid: A. Klassikaline blastotsüsti injektsioon (Robertson et al., 1986) dpc 3.5; blastotsüst; 10-15 rakku; retsipient 2.5 dpc B. Injektsioon tetraploidsesse embrüosse (Wang et al., 1997) dpc 1,5; 2-raku st; 90V, 100 µsek – 1-rakuline teraploid; 48 h 37 0 C 5% CO2 - blastotsüstid; 10-15 ES-rakku; retsipient 2,5 dpc C. Injektsioon kompaktsesse moorulasse (Saburi et al., 1997) dpc 2.5; 8-32 rakku; max 5 ES-rakku; retsipient 2.5 dpc

19. Injektsioonisüsteem Zeiss Axiovert Eppendorf manipulaatorid

20. Blastotsüstide eraldamine emakast

21. Petri tass, blastotsüstid, 37 0 C, 5% CO 2

22. ES-rakkude ja blastotsüstide kogumine

23. 129 w4 ES-rakkude 13nes passaaž feederil

24. ES-rakkude süstimine blastotsüsti

26. Kasutatavad hiireliinid: 1.Agregatsioonikatses kasutatakse tavaliselt C57Bl/6I, Balb/C. Rakendatakse superovulatsiooni 2. DNA mikroinjektsiooni tegemisel on viljastatud munaraku doonoriteks FVB/N, C57Bl/6I, CB20, Balb/c ja C3H. Enamasti kasutatakse superovulatsiooni 3. Blastotsüsti doonoritena leiavad kasutust C57Bl/6I, CB20, Balb/C. Võib kasutada superovluatsiooni 4. Retsipinethiirtena (“võõrasemad”) on eksperimendis pseudotiined emased esimese põlvkonna ristandid liinidest C57Bl/6I x Balb/C või C57Bl/6I x CBA, või hiired liinidest CD1, FVB/N